分子植物育种 - page 7

分子植物育种(网络版), 2016 年, 第 14 卷, 第 1001- 1006 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1001- 1006
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Copyright © 2016 5th Publisher 1004
3 建立有效的组织培养和再生体系
3.1 抗坏死
高粱在组织培养的过程中会频繁地向培养基
中释放酚类物质，使得部分植物组织坏死、褐化，
不仅会影响植株的再生，也会对用于转化的农杆菌
株产生毒害(Gurel et al., 2009; Lu et al., 2009)，因
此，组织培养的经验对于建立农杆菌介导的遗传转
化体系是非常必要的 (Saikishore et al., 2011) 。
Nguyen 等 (2007)发现在愈伤组织诱导培养基中添
加活性炭能够减少酚类化合物的产生。其他研究发
现，在共培养基中添加脯氨酸，天冬氨酸，半胱氨
酸和椰子水，能够有效缓解褐化，减少组织坏死，
提高幼胚的成活率(Zhao et al., 2000; Carvalho et al.,
2004; Pandey et al., 2010)。此外，在培养过程中添
加 PVP 或 PVPP 有助于缓解褐化，增加高粱的遗
传转化效率，进一步研究发现 PVPP 阻止褐化的效
果要优于 PVP (Gurel et al., 2009; Lu et al., 2009)。
Wu 等 (2014)通过在培养基中添加硫酸铜和 6-苄氨
基嘌呤使得转化效率达到了 33.2% 。
3.2 受体材料预处理
研究表明，在对受体材料进行农杆菌侵染前进
行适当的预处理能够显著提高转化效率。Nguyen 等
(2007)发现，在农杆菌浸染前冷处理未成熟种子(从
中分离胚外植体)对外植体存活和愈伤形成均有积
极的影响。其中，在 4℃预处理未成熟种子一天，
显著提高了愈伤组织的形成，减少了频繁继代培养
的必要。Gurel 等(2009)将幼胚做 43 ℃热处理 3 min
后转为 25℃冷却，进行农杆菌侵染，获得了 8.3%
的转化效率；但 4℃冷处理则不利于转化。Gurel 等
(2012)采用上述热处理方法对受体材料 P898012 的
幼胚进行预处理后，再进行农杆菌侵染能够显著提
高转化效率，最高可达 7%。
3.3 Vir 区基因的活化
植物受到损伤后会产生酚类物质，透过农杆
菌的细胞膜活化并诱导包括 VirA、VirG 及其他
Vir 区基因的表达。Vir 基因的活化作用于 T-DNA
的加工和转移，T-DNA 进入植物细胞并整合到核
DNA 上 (刘宣雨等, 2011)。然而，高粱组织培养过
程中产生的酚类物质会造成植物的组织坏死和细
胞的程序性死亡，从而抑制农杆菌介导的转化。
因此，在解除酚类物质抑制作用的同时，可以通
过添加诱导物来促进 Vir 区基因的活化和表达。
高粱中常使用农杆菌 Vir 基因诱导物——乙酰丁
香酮(AS)对 Vir 基因进行活化(Cheng et al., 2004)。
Zhao 等 (2000)，Gao 等 (2005a)在农杆菌介导的高
粱遗传转化研究中，采用 100 µmol/L 的 AS 作为
诱导物，获得了较高的转化效率；Jeoung 等 (2002)
对 9 种不同农杆菌/高粱基因型组合添加了 4 种不
同浓度(50~1 000 µmol/L)的 AS ，通过比较其绿色
荧光蛋白基因(gfp) 的瞬时表达情况发现，不同的
农杆菌/高粱基因型组合获得最高 gfp 表达效率所
需的 AS 浓度也不一样。Shridhar 等(2010)在农杆
菌介导的高粱遗传转化研究中，利用 200 µmol/L
的 AS 作为诱导物，最终获得了 4.28% 的转化效
率。Indra Arulselvi 等(2010)通过比较 3 种不同浓
度 AS 对农杆菌介导的高粱遗传转化的影响，发
现浓度在 200 µM 时转化效率最高。
4 利用高效的选择、筛选系统
4.1 选择标记基因
使用选择标记基因可以使转化体在选择压力
下被选择出来。已经报道的农杆菌介导的高粱转
化中广泛使用的标记基因为除草剂抗性基因(bar)
(Zhao et al., 2000; Lu et al., 2009; Indra Arulselvi et
al., 2010; Zhu et al., 2011; Wu et al., 2014)。Bar 基
因编码草丁膦乙酰转移酶(PAT)，可以使转化植株
对除草剂草丁膦(PPT) 及其类似物，如 Basta 、
Liberty 和 bialaphos 等产生抗性。利用 bar 基因能
够精确筛选除草剂抗性基因，但利用 bar 基因进
行选择容易出现逃逸现象，人们担心转基因植株
中的 bar 基因能够通过与高粱的野生近缘种进行
天然杂交而逃逸到环境中，产生抗除草剂的“超
级杂草”(Gao et al., 2005b)。
某些抗生素抗性基因也被用于高粱筛选，如
潮霉素磷酸转移酶基因(hpt) (Carvalho et al., 2004;
Nguyen et al., 2007; Indra Arulselvi et al., 2010;
Shridhar et al., 2010; Ignacimuthu et al., 2014;
Zhang et al., 2014)，新霉素磷酸转移酶基因 (npt II)
(Howe et al., 2006; Zhang et al., 2014)。然而，使用
抗生素抗性基因也可能带来安全隐患——如果这
些基因转移到致病细菌中，会产生让抗生素失效
的“超级细菌”，威胁人类的健康。