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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1021
3.2
广亲和基因
S5
功能标记设计及序列测定
根据已克隆的广亲和基因
S5
的分子信息，基
于广亲和基因存在的
136 bp
的缺失，运用
Primer 3
在线设计引物
(http://frodo.wi.mit.edu/)
，得到检测广
亲和基因
S5
的特异性引物，
S5cpslo-F
：
5'
-
CTGCA
CGTCTTGCT TCTTCA
-
3'
，
S5cpslo-R
：
5'
-
AGCG
AAGACAAAGGGAGTGA
-
3'
，在非广亲和品种中
产物大小为
492 bp
，广亲和品种为
356 bp
。测序引
物：
S5Seq-F: 5'
-
ATGATCTTGCGGAAAACGAC
-
3'
，
S5Seq-R
：
5'
-
GCTCGA TCGGATTAACAAGC
-
3'
，
在非广亲和品种中产物大小为
945 bp
。获得的
PCR
产物直接测序，引物合成及测序均由上海生工生物
工程技术服务有限公司完成。
3.3 DNA
的提取及
PCR
反应程序
利用
CTAB
法提取水稻叶片的总
DNA
(Murray and Thompson, 1980)
，
PCR
反应总体系为
20 μL
，其中
10×Buffer (MgCl
2
) 2.0
μL
，
2.5 mmol/L
dNTP 1.0 μL
，上下游引物各
1.0 μL
(10
μmol/L)
，
Taq
DNA
聚合酶
0.2
μL
(5
U/μL
)
，模板
DNA 2.0
μL
，
ddH
2
O
补足
20 μL
。
PCR
程序为
94
℃预变性
5 min
，
94
℃变性
30 s
，
55
℃退火
30 s
，
72
℃延伸
60 s
，
30
次循环，最后
72
℃延伸
10 min
。
PCR
产物加入指
示剂在
1.5%
的琼脂糖凝胶中电泳
30 min
或直接用
于测序。
3.4
数据分析
5
个品种的序列用
DNAssit 2.2
软件进行序列比
对分析，“-”表示缺失，红色部分表示序列相同，
本文中只显示部分序列。
作者贡献
吴爽和台德卫是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；吴爽完成数据分析，论文的写作；宛
煜嵩、王德正参与实验研究并对论文进行修改；张
效忠提供有关实验材料并参与实验设计，王守海全
面指导实验设计，数据分析，论文的修改。全体作
者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由安徽省农业科学院院长青年创新基
金
(11B10105)
和 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划
(2011AA10A100)
共同资助。
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