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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1121
3.2
交配型测定
将标准交配型菌株及供试菌株分别在
CA
培养
基上培养一周，沿新鲜菌落边缘用灭菌打孔器分别
取直径相同的菌丝块，采用单孢菌落直接配对法培
养观察性器官的产生情况，方法详见
(
郑小波
, 1997,
中国农业出版社
, pp.88-89)
。
3.3
基因组
DNA
的提取与
RAPD
分析
将经过活化的单孢菌株接种于灭菌的
CA (200
g
胡萝卜榨汁
,
蒸馏水
1 000 mL)
液体培养基、摇床
震荡
(100 r/min)
培养
7~10 d
，用双层灭菌纱布收集
菌丝并置于
65
℃恒温箱干燥，取出后直接用于
DNA
提取或-
20
℃保存备用。辣椒疫霉菌基因组
DNA
的
制备采用生工生物工程有限公司生产的
Ezup
株式
真菌基因组
DNA
抽提试剂盒提取
DNA
，用
1%
琼
脂糖胶检测浓度。从上海生工生物工程有限公司所
产的
100
个十核苷酸随机引物中筛选出条带扩增多
且清晰的
31
个随机引物对供试菌株进行
PCR
扩增。
RAPD-PCR
反应参考
Williams
等
(1990)
的方法，反
应体系总体积为
25 µL
，包含
12.5 µL 2×Tap
MasterMix
、
0.4 µmol/L
引物和
15~20 ng DNA
模板。
PCR
反应在
PTC -200
仪上进行，热循环反应参数
为：
94
℃预变性
2 min
，
94
℃变性
1 min
，
36
℃退火
30 S
、
72
℃延伸
2 min
，
40
个循环，最后
72
℃延伸
10 min
，产物
4
℃保存。凝胶扩增产物在含有
Goldview
Ⅰ的
1%
琼脂糖凝胶中电泳
2.5h
，经紫外
透射仪观察照相，所有引物均对受试菌株进行
3
次
重复扩增。
3.4
数据处理
3.4.1
交配型确定
待测菌株的交配型按照如下标准确定：仅与
A1
交配型配对完成有性生殖的为
A2
交配型；仅与
A2
交配型配对完成有性生殖的为
A1
交配型；与
A1
、
A2
交配型配对均能完成有性生殖，但单株培
养不能完成有性生殖的为
A1,A2
交配型；与
A1
、
A2
交配型配对均不能完成有性生殖的为
A0
交配
型；单株培养即可完成有性生殖的为
A1A2
交配型，
方法参考
(
郑小波
, 1997,
中国农业出版社
, pp.31)
。
3.4.2
多态性分析
观察每个位点扩增条带的有无，有带记为
“1”
，
无带记为
“0”
，形成
“0
，
1”
数据构成的原始矩阵。利
用
NTSYS-PC Version 2.11
软件计算遗传相似系数，
采用非加权组平均法
(UPGMA)
进行
SAHN
聚类分
析，生成供试菌株间的遗传聚类图；利用
Popgene32
软件计算群体内及群体间
Nei's
和
Shannon's
多样性
指数。
作者贡献
陈龙是本文实验研究的主要执行人，并主要完成数据分析
及论文写作；袁洁参与实验设计与实验指导；何海永、陈小均、
吴石平参与实验材料选择、实验设计及结果分析；杨学辉、王
云月是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论
文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由贵州省科技攻关项目
(
黔科合
NY
字
(2009)3002)
资助。感谢贵州省植物保护研究所王利爽和谭清
群两位女士在实验过程中给予的帮助，同时感谢中国农业大
学刘西莉教授馈赠标准型实验菌株。
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