Basic HTML Version
张德超等
:
棉花四大栽培种干旱胁迫下叶片蛋白质组分变化
1104
3.3
蛋白组分提取与测定方法
3.3.1
蛋白组分提取
棉花叶片液氮研磨样品均匀，加入
4
倍体积
10% TCA-
丙酮溶液，于-
20
℃放置
2 h (
推荐过夜
)
，
4
℃、
15 000 g
，离心
30 min
，弃上清；沉淀用
4
倍
体积于样品的-
20
℃预冷丙酮溶液，重新悬浮，于
-
20
℃放置
1 h
以上，
15 000 g
离心
30 min
；重复上
一步如此至上清清亮，弃上清，沉淀用真空干燥机
抽干，制备的粗蛋白干粉依次加入
ddH
2
O
、
0.5 mol/L
NaCl
溶液、
75%
乙醇、
0.01 mol/L NaOH
溶液提取
四种组分蛋白
(
王雪等
, 2007;
胡新中等
, 2005)
。
3.3.2
组分蛋白含量测定
使用
GE 2D-Quant
试剂盒进行样品处理，酶标
仪测定
A480
吸光值，标准曲线见图
4
，计算蛋白
浓度。
3.3.3
蛋白组分提取条件的优化
以中
H177
叶片清蛋白为例进行提取条件
的优化，其中提取液体积
/
粗蛋白干粉和震荡时
间对蛋白组分提取影响较大。设置提取液
/
粗蛋
白干粉
30 μL/mg
、
40 μL/mg
、
50 μL/mg
、
70 μL/mg
四个梯度，设置震荡时间
5 min
、
15 min
、
30 min
、
45 min
四个梯度，测定不同提取条件下蛋白浓度。
从表
3
可以看出，提取次数对蛋白质提取量影响
很大，第一次蛋白质提取量最大，第三蛋白质提
取量已不足总量的
10%
，重复一次蛋白质即可基
本提取完全。加入提取液的量对提取的蛋白质浓
度影响较大，按
30 μL/mg
和
40 μL/m
加入提取液，
出样品不能充分溶解，首次提取的蛋白质浓度较
低，仅占总蛋白的一半左右；而按
70 μL/mg
加入
提取液，加入了过多的提取液，导致得到的蛋白质
浓度较低，不利于蛋白质浓度测定；按
50 μL/mg
加
入提取液，粗样品即能充分溶解得到蛋白质浓度
又高，因此，按干粉
/
提取液
50 μL/mg
加入提取
液较合适。震荡时间对蛋白质提取量也有影响：
震荡
5 min
时，蛋白质提取不完全；震荡时间超
过
30 min
，蛋白浓度反而降低，可能是震荡时间
过长造成蛋白降解；震荡
15 min
时，提取的蛋白
溶度最高，较为合适。
图
4
蛋白浓度标准曲线
Figure 4 The standard line of proteins concentration
表
3
不同提取条件下清蛋白浓度
(μg/μL)
Table 3 Albumin concentration under different extraction conditions (μg/μL)
提取次数
Times
A
B
C
D
E
F
G
H
1
1.24
1.45
2.12
1.47
1.87
2.06
1.55
1.46
2
1.46
0.90
0.62
0.53
0.61
0.67
0.69
0.59
3
0.53
0.46
0.35
0.31
0.38
0.32
0.41
0.36
平均值
AVG
1.08
0.94
1.03
0.77
0.95
1.02
0.88
0.83
注
: A,B,C,D:
分别按
30 μL/mg, 40 μL/mg, 50 μL/mg, 70 μL/mg
加入提取液
,
振荡
10 min; E,F,G,H:
分别按
50 μL/mg
加入提取
液
,
振荡
5 min, 15 min, 30 min, 45 min
Note: A,B,C,D: Separately according to 30 μL/mg, 40 μL/mg, 50 μL/mg and 70 μL/mg join extract, shock 10 min; E,F,G,H:
Separately according to 50 μL/mg join extract, shock 5 min, 15 min, 30 min and 45 min
作者贡献
张德超是本研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的
写作；樊保香、王帅主要负责实验材料的种植、王德龙、王
俊娟负责实验材料处理和取样；陆许可、孔静静参与材料材
料的蛋白提取、浓度测定、试验结果分析工作；叶武威是本
实验的构思者及负责人，指导实验设计，结果分析，论文写
作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本 研 究 由 国 家
973
重 点 基 础 研 究 发 展 计 划
(2010CB126006)
资助。作者感谢棉花生物学重点实验室马丽
华老师的技术支持与指导，感谢中棉所植保室路献永、李兆
群在本实验过程中的帮助。