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张安等
:
三浅裂野牵牛
(
Ipomoea trifida
)(
2X
)
谷胱甘肽过氧化物酶
(
GPX
)
基因的克隆与生物信息学分析
1084
图
2
ItGPX
基因
cDNA
扩增结果
注
: M: DNAMarker-D; 1: PCR
扩增目的片段
Figure 2 PCR amplification of
ItAPX
gene from cDNA first
strand
Note: M: DNAMarker-D; 1: PCR amplified fragment
图
3 GPX
进化发育分析
Figure 3 Phylogenetic analysis of GPX
1.2 ItGPX
蛋白理化性质的软件分析
用软件预测
ItGPX
的
ORF
区域编码
169
个氨基
酸，分子量约为
18 696.2
，理论等电点约为
6.32
，负
电荷残基
(Asp+Glu)
为
21
，正电荷残基
(Arg+Lys)
为
21
，不稳定系数
(Instability Index)
为
32.69
，故属于
稳定蛋白，以赖氨酸
(Lys)
含量最高，达到
10.7%
，
并含有
3
个半胱氨酸
(Cys
43
, Cys
72
和
Cys
91
)
。存在大段
亲 水 区
(Met
1
-Gly
31
, Gly
44
-Leu
65
, Gln
74
-Arg
89
,
Cys
91
-Ala
96
, Asp
105
-Pro
113
, Phe
137
-Leu
165
)(
图
4A)
，推
测
ItGPX
属于亲水蛋白，且不含有信号肽序列
(
图
4B)
和跨膜区
(
图
4C)
。亚细胞定位预测结果表明
ItGPX
很可能位于细胞核中
(nucl: 7.0, chlo: 4.0, extr: 1.0,
pero: 1.0)
，与亲水性和跨膜预测结果相符合。磷酸
化修饰位点分析显示
ItGPX
有
3
个可修饰位点
Ser
6
、
Tyr
50
和
Ser
154
。
1.3 ItGPX
高级结构预测
保守结构域分析表明
ItGPX
属于谷胱甘肽过氧
化物酶家族
(
图
4D)
。经
PSIPRED
预测表明
ItGPX
包
括
5
个
α-
螺旋、
6
个
β-
折叠和多个无规则卷曲
(
图
5A)
，
使用
3D-JIGSAW
同源建模，结果如图
5B
所示。
2
讨论
RNA-Seq
是近年来发展起来的一种测序技
术，广泛应用于转录组测序、新基因挖掘、可变剪
接等研究领域
(Grabherr et al., 2011)
。得益于
RNA-Seq
的出现，使得甘薯研究进入一个新的阶段
(Tao et al., 2012; Wang et al., 2010; Xie et al., 2012;
Zhou et al., 2012)
。本实验室也开始尝试使用这种
方法研究甘薯野生资源，希望从中得到一些基因以
供甘薯育种利用。
本文根据转录组拼接结果设计特异引物，使用
RT-PCR
扩增得到了
ItGPX
序列，经测序发现两者序
列完全一致，说明
RNA-seq
拼接结果的正确性和可
靠性，也表明使用
RNA-seq
拼接序列为基因克隆提
供诸多便利。
我们对
ItGPX
编码的蛋白进行了分析和预测。
植物
GPX
是一个包括多种同工酶的家族，这些同工
酶在亚细胞位置、亚基结构、一级结构和酶学特点
上显著不同，但都具有高度保守区域
(Faltin et al.,
2010)
。与动物
GPX
活性中心的重要构成成分是硒代
半胱氨酸不同，植物
GPX
的氨基酸序列携带的是
一个半胱氨酸残基，即植物中的
GPX
酶蛋白不含有
硒
(Faltin et al., 2010)
。本文所获得的
ItGPX
也在
Cys
43
处替代了动物
GPX
的硒代半胱氨酸，并且具有
3
个标志性
Cys
，说明
ItGPX
属于谷胱甘肽过氧化物
酶家族。
分析结果还显示
ItGPX
有多个磷酸化修饰位
点，定位于细胞核内，推测
ItGPX
可能在细胞核内
发挥作用，可能会保护
DNA
免受氧化损伤。
GPX
一
般只作为胁迫抗氧化的指标之一，近年来发现
GPX
不仅有抗氧化的功能，还能和其他蛋白相互作用
(Holmes-Davis et al., 2005)
。因此，
ItGPX
的确切功
能值得深入研究。
ItGPX
和甘薯
IbGPX
核苷酸序列和氨基酸序列
高度一致性
(99%)
以及进化发育分析结果表明两者
的亲缘关系十分密切，与前人分析结果基本一致
(Gao et al., 2011; Srisuwan et al., 2006)
，在一定程度
上佐证了甘薯起源于三浅裂野牵牛的假设。