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张安等
:
三浅裂野牵牛
(
Ipomoea trifida
)(
2X
)
谷胱甘肽过氧化物酶
(
GPX
)
基因的克隆与生物信息学分析
1086
甘薯是一种重要的粮食作物，同时也是重要的
饲料和工业原料。但是近年来发现甘薯育种亲本有
限，导致遗传背景狭窄、育种进程缓慢，人们再次
考虑从野生资源中引入优异基因来提高甘薯某些
方面的特性
(Liu, 2011)
。本文首次从甘薯祖先种三
浅裂野牵牛中克隆了一个具有完整编码区的
GPX
基因，并附加了酶切位点，可直接用于构建表达载
体，为下一步研究该基因的功能和甘薯抗逆转基因
育种提供了基础。
3
材料与方法
3.1
实验材料
实验材料为三浅裂野牵牛二倍体，保存于江苏
徐州甘薯研究中心资源圃内。收集根、茎、叶和花
速冻于液氮中备用。
3.2
实验方法
3.2.1
转录组测序和拼接
转录组测序和拼接等工作由上海美吉生物技
术公司完成。
3.2.2
总
RNA
的提取及
cDNA
第一链的合成
总
RNA
提取方法参照高纯总
RNA
快速提取试
剂盒
(Trizol-
离心柱型
)(
上海捷瑞
)
说明书。经核酸
测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测产量和质量后，保存
于-
80
℃超低温冰箱中备用。
cDNA
第一链的合成
方法参照
HiScript
TM
1
st
Strand cDNA Synthesis Kit
(
南京
Vazyme)
说明书。
3.2.3 PCR
扩增
根据本实验室前期三浅裂野牵牛转录组拼
接结果设计特异引物，
5'
端引物序列为：
5'
-
TGCTCTAGAATGGCCGCAGAATCAAGC
-
3'(
下划
线部分为
Xba
Ⅰ酶切位点及保护碱基
)
；
3'
端引物序
列为：
5'
-
CGAGCTCTTAAGATATCCCCATCAG
-
3'
(
下划线部分为
Sac
Ⅰ酶切位点及保护碱基
)
。引物由
上海生工合成。以
cDNA
第一链为模板进行
PCR
扩
增，反应体系为
(20 μL)
：
10×Buffer 2 μL
，
10 mmol/L
dNTP 0.5 μL
，
10 pmol/L
引物
1 μL
，
cDNA 1 μL
，
5 U/μL
Taq
酶
0.2 μL
，
ddH
2
O 14.3 μL
。反应程序为：
94
℃预
变性
4 min
；
94
℃变性
45 s
，
55
℃退火
30 s
，
72
℃延
伸
1 min
，
35
次循环；
72
℃延伸
10 min
，
4
℃保存。
3.2.4 PCR
产物的克隆
PCR
产物经
1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测后，用
GenClean
柱式琼脂糖凝胶
DNA
回收试剂盒
(
上海捷
瑞
)
回收。回收产物与
pTG dual-T (
上海捷瑞
)
载体连
接，连接产物转化
DH5α
感受态细胞，随机挑取
6
个
抗性克隆，经菌落
PCR
检验后，将
3
个阳性克隆送至
南京思普金生物科技公司测序。
3.2.5
生物信息学分析
利用生物信息学分析软件对所得基因序列及
其编码蛋白进行生物信息学分析和预测。具体分析
内容和工具参见表
1
。
表
1
本文所用生物信息学工具及网页地址
Table 1 The bioinformatic tools and website addresses referred in this study
检索内容
Items
分析工具
Softwares
理化性质
Physicochemical Property
ProtParam: http://www.expasy.org/tools/protparam.html
亲
/
疏水性
Hydrophylic/Hydrophobic
ProtScale: http://cn.Expasy.org /tools /protscale.html
信号肽
Signal Peptide
SignalP 3.0 Server: http://www.Cbs.Dtu.dk/services/SignalP-3.0
跨膜区预测
Transmembrane Domain Prediction
TMHMM Server: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
亚细胞定位
Subcellular Localization
WoLFPSORT: http://psort.Hgc.jp
保守结构域
Conserved Domain
InterProScan: http://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=iprscan
二级结构预测
Secondary Structure Prediction
PSIPRED: http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/
3D
同源建模
3D Homology Modeling
3D-JIGSAW: http://bmm.cancerresearchuk.org/~3djigsaw/
系统发育分析
Phylogenetic Analysis
MRGA5.10: http://www.megasoftware.net/