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查中萍等：
Bt
水稻
T1C-19
中外源基因的三引物多重
PCR
检测方法
1112
3.2.4
二引物
PCR
扩增特异性检测
PCR
反应体系为
15 μL
，其中包含
10×PCR
缓
冲液
(
含
Mg
2+
) 1.5 μL
，
2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL
，
5 U/μL
Taq
DNA
聚合酶
0.2 μL
，
DNA
模板
1 μL
，
10 µmol/L
引物
C1
、
C2(
或者
C1, C3)
使用量分别为
0.3 μL
。
PCR
反应程序为
94
℃反应
4 min
，然后进
入三温度循环，每个循环包括
94
℃反应
40 s
，
55
℃
反应
30 s
，
72
℃反应
30 s
，共
30
个循环，最后
72
℃
反应
5 min
。
3.2.5
二引物
PCR
扩增产物测序
PCR
产物经
0.8%
的琼脂糖凝胶电泳分离后，
回收包含目标片段的胶块，用上海生工生物工程
技术有限公司生产的
DNA
胶回收试剂盒回收目
标片段
DNA
，送南京金斯瑞生物科技有限公司进
行测序。
3.2.6
三引物多重
PCR
检测体系
PCR
反应体系为
15 μL
，其中包含
10×PCR
缓冲液
(
含
Mg
2+
) 1.5 μL
，
2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL
，
5 U/μL
Taq
DNA
聚合酶
0.2 μL
，
DNA
模板
1 μL
和
适当量的三引物
C1
、
C2
、
C3
。
C1
、
C2
和
C3
的浓
度为
10 µmol/L
，引物使用量根据优化结果确定。
PCR
反应程序为
94
℃反应
4 min
，然后进入三温度
循环，每个循环包括
94
℃反应
40 s
，
55
℃反应
30 s
，
72
℃反应
30s
，共
30
个循环，最后
72
℃反应
5 min
。
作者贡献
査中萍、万丙良和杜雪树是本研究的实验设计和执行
人；査中萍参与实验设计、实验操作、数据分析和论文写作；
万丙良是项目的构思者和负责人，指导实验设计、数据分析、
论文写作和修改；杜雪树参与实验操作和数据处理。
致谢
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项
(2011ZX08001-001)
及湖北省农业科技创新中心资助项目
(2007-620-001-03)
共同资助。作者感谢华中农业大学作物遗
传改良国家重点实验室
/
国家植物基因研究中心
(
武汉
)
林拥
军教授提供的
Bt
水稻
T1C-19
。感谢两位匿名的同行评审人
的评审建议和修改建议。
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