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查中萍等：Bt 水稻 T1C-19 中外源基因的三引物多重 PCR 检测方法
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表 1 转基因水稻 F2 代和 F3 代材料的三引物多重 PCR 检测结果
Table 1 The results of tri-primer multiplex PCR in F2 and F3 breeding populations
F1 代组合
F1 hybrid combinations
F2 代 PCR 检测株数
The plant number detected
with PCR in F2 population
F2 不同基因型植株数
The genotype and plant number of
F2 population
F3 家系基因型
The genotypes of F3 lines
9311/T1C-19 10 RR
Rr
rr
2
5
3
RR
RR、Rr、rr
rr
R838/T1C-19 10 RR
Rr
rr
2
6
2
RR
RR、Rr、rr
rr
宜恢 72/T1C-19
Yihui72/ T1C-19
10 RR
Rr
rr
1
6
3
RR
RR、Rr、rr
rr
注: RR: 基因纯合; Rr: 基因杂合; rr: 阴性
Note: RR: The homozygous; Rr: The heterozygous; rr: The negative
多重 PCR 技术利用一次 PCR 反应检测多个靶
标 DNA 片段，比传统 PCR 省时省力。该技术已广
泛地应用于转基因植物的检测，主要是用于同时检
测多个外源基因成分的存在( 吴影等, 2006; 武海斌
等, 2009; 魏霜等, 2012)，也有利用外源基因插入的
侧翼序列设计共显性引物标记进行多重 PCR 检测
转基因的基因型( 欧阳波等, 2006; 贾芝琪等, 2009;
张焕春等, 2012)。本研究针对 T1C-19 中特异转化
事件，设计了同时检测 2 个靶标片段的 3 个共显性
引物标记 C1 、C2 和 C3 (图 6)及其三引物多重 PCR
体系。多重 PCR 技术的难点主要体现在反应体系的
不平衡。反应体系的不平衡导致在前面几轮循环中
优势引物的扩增产物大量增加，而这些大量增加的
产物又对 DNA 聚合酶起抑制作用 (Santalucia,
2007)，从而使前期处于劣势的引物的扩增产物效率
越来越低。引物设计的缺陷是导致反应体系的不平
衡的主要原因，包括引物退火温度不一致，特异性
差，存在二聚体等 ( 胡毅玲等 , 2001; 黄银花等 ,
2003)。本文根据 2 个靶标片段所设计的引物退火温
度相同，都是 55℃，引物经过 Blast 分析，特异性
强且不存在二聚体。利用这些引物分别进行单一
PCR 扩增都能特异地扩增出目标 DNA 片段。有大
量研究表明，在成功的单一 PCR 扩增条件下，进行
多重 PCR 反应，一般都能得到较好的扩增结果
(Arlorio et al., 2002; Ma et al., 2003; 王凤格等,
2003)。本文设计的 3 个引物中，其中 1 个引物为共
用的上游引物。因此在建立多重 PCR 体系时先从反
应体系中的引物配比上着手，其他反应体系如 DNA
模板浓度、dNTP、DNA 聚合酶用量保持与单一 PCR
一致，这样既可以简化多重 PCR 反应体系，又可以
解决多重 PCR 中多个产物不对称扩增。本研究设计
的三引物 PCR 扩增体系扩增产物条带清晰，产物测
序结果正确。用该体系对不同的转基因杂交组合及
其亲本材料进行检测，均能区分转基因杂合、转基
因纯合和转基因阴性三种基因型。通过对 T1C-19
不同转基因杂交组合的分离世代 F2 代基因型检测
及对 F3 家系基因型的进一步验证，结果表明该体系
对 T1C-19 不同转基因杂交后代的基因型鉴定准确
率达到 100%，说明该体系可以用于 T1C-19 及其衍
生系中的 cry1C 基因型检测。
利用已有的 Bt 水稻资源进行抗螟虫水稻育种
是防治水稻螟虫的有效途径， C1+C2+C3 三引物多
重 PCR 检测方法的建立为利用 T1C-19 进行抗螟虫
水稻分子育种提供了一个简便有效的基因鉴定技
术，有利于提高对 cry1C 基因的检测效率，加快抗
螟虫水稻育种进程。
3 材料与方法
3.1 水稻( Oryza sativa L.) 材料和试剂
转 cry1C 基因纯合系 T1C-19 由华中农业大学
作物遗传改良国家重点实验室 /国家植物基因研究
中心( 武汉)提供。非转基因水稻 9311、辐恢 838、
宜恢 72 由作者实验室保存。
以非转基因水稻 9311、辐恢 838、宜恢 72 为