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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1090
控制
(Cai et al., 1998)
。基于此原理，蔡秀玲等
(2002)
创立了
Wx
基因的
PCR-AccI
分子标记，该标记经
PCR
扩增后，用
AccI
酶消化，以
2%
的琼脂糖凝胶
电泳后，
GG
基因型的
DNA
模板仅出现
403 bp
片段，
TT
基因型的
DNA
模板仅有
460 bp
条带，而
GT
杂
合基因型同时有
403 bp
和
460 bp
条带。利用该标记
对
63
个水稻亲本进行了检测，结果表明，
GG
基因
型的水稻品种直链淀粉含量在
20%~32%
之间，而
TT
基因型的直链淀粉含量都小于
18%
。随后，
Mao
等
(2004)
建立了能特异扩增第一内含子
+1
位正常
G
碱
基的一步
PCR
显性标记，但该标记在
PCR
扩增时需
将退火温度提高到
67
℃以提高扩增特异性，因而其
缺点是扩增要求较高，容易出现
PCR
扩增失败而造
成
G
碱基检测不到的现象。
直链淀粉含量是影响稻米蒸煮和食味品质的
重要因子。因此，开发出有效的
Wx
功能标记具重
要意义。而以上两种功能标记缺点显而易见，一种
是需要酶切消化，因而成本较高，操作繁琐而不利
于高通量的分子标记辅助育种；另一种虽然是基于
SNP
设计的显性分子标记，但退火温度较高而较难
把握，如退火温度偏低，则该位点无论是
G
或为
T
均可扩增出条带，而退火温度偏高，则很难扩增出
条带。有鉴于此，本文设计了一种基于该
SNP
带阳
性对照的功能标记
M-Wx
，该标记在退火温度为
55
℃时即可正常扩增，
1.2%
琼脂糖凝胶电泳后可检
测等位碱基的差异。本研究通过检测
72
个水稻亲
本基因型与直链淀粉含量的关系，来验证该功能标
记
M-Wx
的有效性，从而
M-Wx
应用于直链淀粉的
育种应用提供一定理论基础和实践意义。
1
结果与分析
1.1
引物设计
根据引起蜡质基因功能变化的单碱基突变，
G-T
差异位置的序列设计能特异扩增突变型
T
的引
物
WxT
，并在
3'
端第四个位置引入一个错配以加强
特异性，在其上游和下游分别设计一条正向引物
WxF
、下游设计一条反向引物
WxR (
表
1)
。当水稻
DNA
模版在该
G-T
位置有为
TT
型或
GT
型存在时，
将会扩增出
228 bp
和
428 bp
两条带，而该位置为
GG
型时，则只有
425 bp
的对照条带
(
图
1)
。
表
1
标记
M-Wx
信息表
Table 1 Information of marker M-Wx
引物名
Primer
序列
Sequence
位置
Location
多态性
Polymorphism
WxF
AGAGGGGGAGAGAGAGAaCG
1764537-1764556
228bp/425bp
WxT
CAGGAAGAACATCTGCgAGT
1764734-1764753
WxR
CCTAACCAAACATAACGAACG
1764941-1764961
注
:
位置为引物序列在日本晴第
6
染色体的序列位置
Note: Location, primer sequences in Nipponbare sequence of chromosome
图
1 M-Wx
扩增示意图
Figure 1 Diagram of PCR amplification with primers
1.2
标记
M-Wx
在水稻亲本中的等位分布与直链淀
粉的相关性
为了检验功能标记
M-Wx
检测的基因型与直
链淀粉含量的相关性，我们选择了
72
份遗传稳
定、
Wx
基因为纯合状态的水稻亲本。用标记
M-Wx
经
PCR
扩增，
1.2%
琼脂糖凝胶电泳检测后
发现，
72
个亲本均扩增出产物，出带率为
100%
，且
条带清晰
(
图
1;
图
2)
。有
43
份水稻亲本有
228 bp
和
425 bp
两条带，基因型记为
TT
，其直链淀粉均小
于
15.3%
，其直链淀粉的平均值为
12.5%
；有
29
份水稻亲本只有
425 bp
条带，基因型记为
GG
，
其直链淀粉均高于
20.7%
，其直链淀粉的平均值
为
22.3% (
表
2)
。结果表明，
M-Wx
检测
72
份水
稻亲本的基因型与直链淀粉含量的表型完全吻
合，
M-Wx
检测为
TT
型的
42
份非糯性水稻亲本
直链淀粉含量为
9.1%-15.3%
；
M-Wx
检测为
GG
型的
29
份水稻亲本直链淀粉为
20.1%~25.6%
。因