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分子植物育种(网络版), 2012 年, 第 10 卷, 第 1383- 1389 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1383- 1389
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
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Promega 公司，PCR-selectTM cDNA subtraction kit
以及 AdvantageTM cDNA Polymerase Mix 购于
Clontech 公司，pMD-19T 载体购于 TAKARA 公司。
试验菌丝培养所用基本培养液为 MMN (Melin-
Norkrans Medium)培养液，去除其中的麦芽提取物，所
用氮源为(NH4)2 HPO4，终浓度 3.8 mmol/L，转速 150
r/min 摇床内连续暗培养 15 d，温度为(25±1)℃。
3.2 方法
3.2.1 试验材料处理
菌株培养 15 d 后，过滤收集菌丝，重悬于新鲜
MMN 培养液中振荡培养 24 h，再次过滤，一半重悬
于新鲜 MMN 培养液中振荡培养，作为对照组；一
半重悬于以 100 µmol/L Ca(NO 3)2 为唯一氮源的
MMN 培养液中，进行硝态氮诱导，作为处理组，分
别振荡培养 4 h、8 h、24 h、36 h 取材，液氮速存。
3.2.2 总 RNA 的提取及 mRNA 的纯化
菌丝总 RNA 利用鼎国公司的 PlantRNAzol 试
剂盒提取，步骤同试剂盒说明书。用 1%琼脂糖凝胶
电泳，检测 RNA 提取质量，并用微量紫外分光光度
计测定其纯度和浓度；采用 Promega 公司的 PolyA
Tract SystemsⅢ (Z5300)分离 mRNA，并利用琼脂
糖凝胶电泳检测其完整性。
3.2.3 抑制性差减杂交
采用 Clontech 公司的 PCR-selectTM cDNA Sub-
traction Kit 试剂盒,并按其说明书进行。
3.2.4 差减 cDNN 文库的构建及序列分析
第二轮 PCR 扩增结束后，将产物与载体 pMD-
19T 连接，再转化大肠杆菌感受态细胞 DH5a，完成
cDNA 文库构建。随机选择 300 个阳性克隆进行测
序，去除测序序列中的载体序列和接头序列后，即得
EST 序列，于 NCBI 上进行 Blast 同源比对及功能注
释后，将所得 ESTs 进行基因功能分类。
作者贡献
张春英、孙秋玲是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，张春英是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据
分析，论文写作与修改；戴思兰指导论文的写作与修改。全
体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目(30972409)资助。作者
感谢上海市园林科学研究所尹丽娟、魏翔莺、黄芳以及师姐
陈真在本实验过程中的帮助。感谢两位匿名的同行评审人的
评审建议和修改建议。
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