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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1346
-
1353
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1346
-
1353
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1351
3
材料与方法
3.1
参试品种及播期
试验于
2008
年秋季在广西农业科学院蔬菜中
心蔬菜基地进行，品种编号见表
1
。直播。从每个品
种选择
10
株记录齐口期和叶片数，采集叶片用液
氮冷冻于-
70
℃冰箱。
3.2 DNA
提取
采用
CTAB
的方法：取
2~3 g
叶片，用液氮研碎，
加入
DNA
提取液
(
含
1.5%
的
CTAB, 1%
巯基乙醇
)
，
65
℃水浴
90 min
，加入氯仿
:
异戊醇
(24:1)
，抽提
2
次后，加
RNA
酶
37
℃温浴过夜，苯酚
:
氯仿
:
异戊醇
(25:24:1)
纯化，样品
DNA
用
ddH
2
O
溶解和保存。
3.3 MSAP
分析
参照
Xiong
等
(1999)
和陆光远等
(2005,
科学通
报
, 50(24): 2750-2756)
的方法。酶切连接一步法反应
体系和步骤：
25 µL
反应体系：
Mse
I adaptor (50 pmol/µL)
1 µL
，
Eco
R I adaptor (5 pmol/µL) 1µL
，
T4 buffer 2.5 µL
，
T4 ligase 1.5 U
，
100
×
BSA 0.25 µL
，
MseI 3 U
，
Eco
R
I 3 U
，
DNA 2 µL
，双蒸水补足至
25 µL
。将上面反应
体系的
PCR
管在
37
℃水浴锅中处理
10 h
，然后转
到
70
℃处理
15 min
，稀释
10
倍，作为预扩增模板。
预扩增体系：
10
×
buffer 2 µL
，
Mg
2
CL (25 mmol/L)
1.6 µL
，
dNTP (10 mmol/L) 0.4 µL
，
Taq
酶
(2 U/µL)
0.5 µL
，
Mse
I (50 ng/µL) 1 µL
，
Eco
R I (50 ng/µL)
1 µL
，
DNA 3 µL
，
H
2
O 12.1 µL
。反应条件：
94
℃预
变性
3′
；
94
℃变性
30″
，
56
℃退火
30″
，
72
℃延伸
1′
，
一共
25
份循环；
72
℃延伸
7′
；
4
℃保存。预扩增引物
序列参考
Salmon
等
(2008)
。选扩增体系：
10
×
buffer
2 µL
，
Mg
2
Cl (25 mmol/l) 1.6 µL
，
dNTP (10 mmol/L)
0.4 µL
，
Taq
酶
(2 U/µL) 0.5 µL
，
Mse
I ( 50 ng/µL)
1 µL
，
Eco
R I ( 50 ng/µL) 1 µL
，
DNA3 µL
，
H
2
O 12.1 µL
。
反应条件：
94
℃预变性
3′
；
94
℃变性
30″
，
65
℃退
火
30″
每循环下降
0.7
℃，
72
℃延伸
1′
，一共
23
份
循环；
72
℃延伸
7′
；
4
℃保存。
6%
聚丙烯酰胺胶电
泳检测扩增产物，银染法染色显影。
3.4
数据分析
采用
DPS
数据处理系统对开花期和叶片数进行
系统聚类分析。
MSAP
分析参考
Salmon
等
(2008)
，
记载选择性扩增反应的条带数，清晰可见的条带设
为
1
，肉眼不可见或模糊不清的条带设为
0
，将统计
的条带记为数字矩阵，利用
Excel
计算甲基化多态性
比率和甲基化类型。利用
GenAlEx 6.4
软件计算
Nei
分子遗传距离和聚类分析，利用
mantel
检验；两种
分析的遗传距离相关性。
作者贡献
史卫东是本项目的实验设计、实验研究和数据分析的执
行人，完成论文写作与修改。李秋雯参与
MSAP
实验；黄如
葵、赵坤提供部分试验材料；王益奎参与数据分析。全体作
者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究获得广西农业科学院基本科研业务专项
(2012JZ06
和桂农科
2012YT05)
、广西作物遗传改良生物技术
重点实验室开放课题子课题
(
桂科能
0815011
-
6
-
1)
资助。感
谢评审人的评审意见和修改建议。
参考文献
Bossdorf O., Arcuri D., Richards C.L., and Pigliucci M., 2010,
Experimental alteration of DNA methylation affects the
phenotypic plasticity of ecologically relevant traits in
Arabidopsis thaliana
, Evolutionary Ecology, 24(3): 541-553
http://dx.doi.org/10.1007/s10682-010-9372-7
Burn J.E., Bagnall D.J., Metzger J.D., and Dennis E.S., 1993,
DNA methylation, vernalization and the promotion of
flowering, Proc Natl Sci USA, 90:287-291 http://dx.doi.org/
10.1073/pnas.90.1.287 PMid:11607346 PMCid:45645
Cervera M.T., Ruiz-Garcia L., and Martinez-Zapater J.M., 2002,
Analysis of DNA methylation in
Arabidopsis thaliana
based on methylation-sensitive AFLP markers, Mol. Genet.
Genomics, 268(4): 543-552 http://dx.doi.org/10.1007/
s00438-002-0772-4 PMid:12471452
Chen W.W., Liu H.C., Chen R.Y., Song S.W., and Sun G.W.,
2011, Genetic diversity analysis of Chinese Kale
germplasm resources by RAPD markers, Zhongguo
Nongxue Tongbao (Chinese Agricultural Science Bulletin),
27(8): 150-155 (
陈文文
,
刘厚诚
,
陈日远
,
宋世威
,
孙
光闻
, 2011,
基于
RAPD
标记的芥蓝种质资源遗传多样
性分析
,
中国农学通报
, 27(8): 150-155)
Finnegan E.J., Genger R.K., Kovac K., Peacock W.J., and
Dennis E.S., 1998, DNA methylation and the promotion of
flowering by vernalization, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95(10): 5824-5829 http://dx.doi.org/10.1073/pnas.95.
10.5824 PMid:9576969 PMCid:20464
Finnegan E.J., Kovac K.A., Jaligot E., Sheldon C.C., Peacock W.J.,
and Dennis E.S., 2005, The down regulation of FLOWER-
ING LOCUS C (FLC) expression in plants with low levels of
DNA methylation and by vernalization occurs by distinct
mechanisms, The Plant Journal, 44(3): 420-432
http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-313X.2005.02541.x