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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1331
-
1337
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1331
-
1337
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1335
作为黄萎病保持和更新菌种，用于病圃的棉籽残渣
不少于
1 200 g/m
2
土壤，带菌残渣均匀地施入田间，
再翻耕
2~3
遍，使病菌与土壤混均匀，保证病圃土
壤病菌数量在
200/g
土壤以上，减缓病圃衰退
(
张永
军等
, 2008,
中国专利
, ZL200810222492.3)
。
选择中植
372
及候选抗病组合材料种植在黄萎
病病圃中，
3
次重复，每个重复
2
行，按棉花正常
的播种时间和田间管理方式进行种植，田间保持适
当湿度，以利于黄萎病的发生。依据《棉花抗病虫
性评价技术规范-第
5
部分：黄萎病》规定的鉴定
标准
(GB/T22101.5
-
2009)
，选择病情指数小于
20
的
材料进行分子标记跟踪检测，选用的分子标记为利
用抗病材料中植
372
和感病材料军棉
1
号配制组合构
建的
F
2
作图群体所筛选出与黄萎病抗性紧密连锁的
SSR
标记
NAU1269
。将筛选的含有抗性标记抗病材
料后代通过种间杂交、回交、海南加代选育、再杂交
并重复辅以病圃高压选择和分子标记跟踪，直至筛选
出具有抗黄萎病、产量高、品质优良的品系材料。
3.2
选育品种与
SSR
引物
选取本研究培育的大面积推广的
5
个抗或者高
耐黄萎病棉花品种，分别为中植棉
2
号、中植棉
6
号、中植棉
8
号、新植杂
2
号和新植
5
号，以抗病
亲本中植
372
及
3
个高感黄萎病棉花品种军棉
1
号、
新陆早
8
号和冀棉
11
号为对照
(
表
1)
，鉴定棉花抗
黄萎病
SSR
标记与棉种抗性的关系。
NAU1269
为本研究利用抗病材料中植
372
和
感病材料军棉
1
号配制组合构建的
F
2
作图群体所筛
选到的与黄萎病抗性紧密连锁的
SSR
标记。与陆地
棉黄萎病抗性相关的
SSR
引物
NAU828 (Yang et al.,
2008)
和
NAU1225 (
蒋锋等
, 2009,
中国科学
, 39(9):
849-861)
由南京农业大学张天真教授提供。
3.3 DNA
提取
采用天根新型植物基因组
DNA
提取试剂盒
(
目
录号
: DP320
-
02)
提取供试材料棉花基因组
DNA
。
3.4 PCR
反应体系
PCR
总反应体系为
20 μL
，其中
DNA
模板
(40~
80 ng/μL) 1 μL
，
2.5 mmol/L
的
dNTP 2 μL
，
10
×
Buffer 2 μL
，
10 μmol/L
正反向引物各
1 μL
，
Taq
DNA
聚合酶
(TAKARA,
货号
: DR001A) 0.25 μL
，
加
ddH
2
O
至
20 μL
。
PCR
反应条件为：
94
℃预变性
5 min
；
94
℃变性
30 s
，
56
℃退火
40 s
，
72
℃延伸
30 s
，
32
个循环；最后
72
℃延伸
10 min
，
4
℃保存。
表
1
本研究使用的棉花材料
Table 1 Cotton cultivars used in this study
编号
材料名称
抗病类型
No.
Cultivars name
Resistance type
P
中植
372
抗病
Cv. Zhongzhi372
Resistance
1
新植杂
2
号
抗病
Cv. Xinzhiza2
Resistance
2
中植棉
2
号
抗病
Cv. Zhongzhimian2
Resistance
3
新植
5
号
抗病
Cv. Xinzhi5
Resistance
4
中植棉
6
号
抗病
Cv. Zhongzhimian6
Resistance
5
中植棉
8
号
抗病
Cv. Zhongzhimian8
Resistance
6
军棉
1
号
感病
Cv. Junmian1
Susceptible
7
新陆早
8
号
感病
Cv. Xinluzao8
Susceptible
8
冀棉
11
号
感病
Cv. Jimian11
Susceptible
3.5
电泳检测
取
2 μL PCR
产物在
8%
非变性聚丙烯酰胺凝胶
上恒电压
200 V
电泳
60 min
。采用
NaOH
银染方法
对电泳后的聚丙烯酰胺凝胶进行染色显影。各种溶
剂的配方和体积为：银染液，
0.1%AgNO
3
溶液
1 L
；
显影液，
16 g
的
NaOH
，
8 mL
的
37%
甲醛，加去离
子水定容到
1 L
；终止液，
0.75%
的
Na
2
CO
3
溶液
1 L
。
银染程序为：
(1)
去离子水漂洗
15 s
；
(2)
银染
8 min
；
(3)
去离子水冲洗
15 s
；
(4)
在显影液中轻摇至显带；
(5)
加入终止液，终止显影。
作者贡献
祁伟彦和张永军是本研究的实验设计和实验研究的执
行人；张天真参与实验设计和提供引物；陈捷胤参与数据分
析和论文初稿的写作；戴小枫是项目的构思者及负责人，指
导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读
并同意最终的文本。
致谢
感谢转基因生物新品种培育科技重大专项项目
(2011Z-
X08005)
和国家
863
计划项目
(2006AA10Z177)
的支持。
参考文献
Bai Z.L., and Zhou H., 2008, Study on cucumber downy
mildew and its molecular assisted breeding, Anhui
Nongye Kexue (Journal of Anhui Agriculture Sciences),