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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1526
-
1534
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1526
-
1534
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1532
高的植株，并自交
1
次
(
图
1)
。将选育出纯合抗病的
‘91
-
12B’NILs
与
’91
-
12A’
配制杂交组合，并对其进
行田间农艺性状调查和抗病性鉴定。
3.3
基因组
DNA
的提取
采集亲本以及各世代幼嫩叶片，采用改良
SDS
法
微量提取
DNA (Pierre and Maréchal-Drouard, 1992)
。
用
Thermo NanoDrop 2 000
超微量分光光度计测定
DNA
浓度
3.4
多态性标记筛选
用
CRb
基因连锁的侧翼标记
TCR01
和
TCR09
检测亲本
‘91
-
12B’
与
‘CR Shinki DH’
系间的多态性。
根据芸薹种遗传连锁图谱
(Kim et al., 2009)
，选择覆
盖全基因组的
120
个
SSR
标记用于亲本间多态性筛
选。多态性标记用于基因组背景选择。
TCR01
和
TCR09
的
PCR
扩增反应体系采用
Piao
等
(2004)
方法。
TCR01
和
SSR
标记扩增采用
10 μL
反应体系，包括
15 ng
模板
DNA
、
1×PCR
缓冲液、
0.25 mmol/L dNTP
、
5 pmol/L
上下游引物、
2.5 U
Taq
酶。
PCR
程序采用
Kim
等
(2009)
方法。
PCR
产物用
6%
变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳分离，并用银染方法显色。
TCR09
采用
20 μL
反应体系，扩增产物用
1.5%
琼脂糖电泳分离，溴化
乙锭显色。
3.5
CRb
基因前景选择
各世代的前景选择，先后用
TCR01
和
TCR09
筛
选各世代植株，选择兼具
TCR01
和
TCR09
抗病带型
(‘CR Shinki DH’
系带型
)
的植株用于回交或自交。
为确定用于各回交世代的最小供试群体数，在
10
个
BC
1
F
1
的回交群体中，分别选择
5
、
7
、
10
、
15
和
20
株进行
BC
2
F
1
的前景选择，重复
2
次。
3.6
回交世代基因组背景选择
选择均匀分布于大白菜
10
个连锁群上的
53
个
多态性
SSR
标记，对具抗病带型的
BC
3
F
1
个体进行
‘91
-
12B’
基因组背景选择。在每一连锁群选择
2~3
个遗传距离大、覆盖全基因组的
27
个
SSR
标记，通
过基因型鉴定淘汰轮回亲本基因组含量低的个体，
然后选用其它
26
个
SSR
标记对选出的单株做进一步
背景选择。
RPG
表示单株基因组恢复到轮回亲本的程度。
RPG=SSR
标记纯合位点数
/SSR
标记总数
×100%
。平
均基因组含量为相同世代群体内各个体基因组含
量的平均值。
RPG
期望值
=(1
-
1/2
r+1
)×100%
，式中
r
为回交次数。
选择
RPG
高于其期望值的单株自交，获得纯合
抗病的
NILs
。
NILs
的纯合抗性采用共显性标记
TCR01
的基因型和抗病性鉴定相结合的方法。选用
CRb
所在
A3
染色体的
SSR
标记
(Ramchiary et al., 2011)
分析抗根肿病
NILs
中供体亲本染色体片段的插入。
3.7
杂交组合的配制
以
’91
-
12A’
为杂交亲本，分别与
‘91
-
12B’
以及抗
根肿病
NILs
包括
B1S1
、
B2S2
和
C3S1
进行杂交，得到
F1
种子，用于抗病性鉴定和田间农艺性状调查。
3.8
抗病性鉴定
将
‘91
-
12A’
、
‘91
-
12B’
、
‘CR Shinki DH’
系、
B1S1
、
B2S2
、
C3S1
以及这些
NILs
与
‘91
-
12A’
的杂交种种子
播种于
50
孔穴盘，每份材料播种
25
粒种子。出苗后
3 d
，
利用灌根法接菌
(
接种根肿菌孢子浓度为
1× 10
7
/mL)
。
接菌期间保持土壤湿润、温度
20
℃
~25
℃。接菌后
6
周，
清洗根部泥土，调查发病情况。根据
Buczacki
等
(1975)
方法，发病程度按
0~3
级进行分类，标准为：
0
级，主
侧根均无肿瘤；
1
级，侧根有微小肿瘤；
2
级，侧根
有较大瘤或主根有节状小瘤；
3
级，主侧根有明显
肿瘤。抗病性鉴定在沈阳农业大学试验基地进行。
3.9
结球相关性状调查
将
‘91
-
12B’
、
‘91
-
12A×91
-
12B’
、近等基因系
B1-
S1
、
B2S2
、
C3S1
以及各
NILs
与
‘91
-
12A’
的杂交种种
子播种于穴盘中。
20 d
后在沈阳农业大学蔬菜分子生
物学试验基地进行定植。各家系和杂交组合定植
25
株，设置
3
次重复。收获期随机抽取
12
株，对大白菜
结球相关性状进行调查，包括：全株质量、外叶数、
叶球重、叶球高度、叶球直径、内叶数、营养茎茎高
以及茎基部直径等
(
朴钟云等
, 2010)
。利用
DPS
软件
分析差异显著性。
作者贡献
张腾是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成
论文初稿的写作；吴迪、赵卓及王哲参与实验设计，试验结果
分析；朴钟云是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据
分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金
(31171967)
、辽宁省自然科
学基金项目
(20102199)
和教育部高等学校博士学科点专项
科研基金
(20092103110006)
共同资助。