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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1511-1517
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1511-1517
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1516
图
8
甘薯转基因诱导前后
GUS
染色
注
: A:
转基因植株
GUS
染色
; B,C: 5%
蔗糖诱导后
GUS
染色
Figure 8 GUS staining of transgenic sweet potato and sucrose-
inducible transgenic sweet potato
Note: A: GUS staining of transgenic plants; B,C: GUS staining of
sucrose-inducible transgenic plants at 5% sucrose concentration
TTGCCAAACAGAGCCTAAATCCATC
，
R
：
GGAT-
CCTCATGGTGG CAGATGAGATGACAA
，下划线的
序列分别为引入的限制性内切酶
Hin
d
Ⅲ、
Bam
H
Ⅰ
的识别位点。
PCR
扩增片段，扩增条件为：
94
℃
5 min
，
94
℃
1 min
，
56
℃
1 min 20 s
，
72
℃
1 min
，
30
个循
环。电泳检测
PCR
产物，回收片段与克隆载体
PMD19
-
T
连接，亚克隆测序。
3.2
载体构建
用
SpoA-p
替代表达载体
PBI121
中的
CaMV35s,
启动
GUS
基因表达。用
Hin
d
Ⅲ及
Bam
H
Ⅰ同时双酶
切含有
SpoA-p
的
PMD19
-
T
及植物表达载体
PBI121
的质粒
DNA
，回收
SpoA-p
与
PBI121
大片段，
T
4
酶连
接，转入感受态细胞
JM109
中。挑取阳性克隆，提
取质粒
DNA
，利用
Hin
d
Ⅲ及
Bam
H
Ⅰ双酶切验证
pBI-SpoA-p::GUS
连接成功与否。采用根癌农杆菌
EHA105
构建工程菌株
EHA105
：
pBI-SpoA-p::GUS
。
3.3
遗传转化
A
烟草：取健壮烟草无菌苗的幼嫩叶片，去主脉，
将叶片剪成
0.5 cm2
的小块。用农杆菌
(EHA105:pBI-
SpoA-p::GUS)
感染后共培养
3 d
；移至含选择压卡那
霉素
(Kana,
购自北京天根生化科技有限公司
)
的分
化培养基上分化出芽；在
MS
培养基上生根再生出
完整植株。
B
甘薯：将甘薯叶片在含
20 μm/L
的
MS
培养基
上
28
℃预培养过夜，农杆菌工程菌株培养至
OD
值
为
0.3~0.5
，侵染甘薯叶片
30 min
；无菌滤纸吸干多
余菌液，接种至含有
20 g/L Glucose
、
0.5 g/L MES
及
200 μm Acetosyingone
共培养基上
28
℃暗培养
3
d
；后转入含有
0.2 mg/L 2,4
-
D
、
0.2 mg/L Zeatin
和
50
mg/L kana
的筛选培养基上培养
60~90 d
；再移至
Gibberellic acid 0.05 mg/L
的分化培养基上进行再生
植株的培养，获得
kana
抗性的甘薯植株。待幼苗长
至
5 cm
左右移栽入土。
3.4
转基因植株的分子检测
提取植株总
DNA
为模板，使用上海生工有限公
司合成扩增长度为
1 000 bp
的
GUS
基因特异引物，
F: 5'
-
TCTGGTATCAGCGCGAAGTCT
-
3', R: 5'
-
TG-
TCACGCGCTATCA GCTCT
-
3'
。
PCR
方法扩增检测
GUS
基因，以质粒
DNA
为阳性对照，未转化的同一
基因型植株总
DNA
为阴性对照。
PCR
采用
25 μL
反
应体系：约
50 ng DNA
模板，
2.5 μL 10
×
PCR Buffer
，
2 μL 2.5 mmol/L dNTPs
，
1.5 μL 25 mmol/L MgCl
2
，
5 μmol/L
的上下游引物各
1 μL
，
1 U
Taq
DNA
聚合
酶。
PCR
特异扩增程序为：
94
℃
5 min
，
94
℃
1 min
，
56
℃
2 min
，
72
℃
1 min
，
30
个循环。
3.5
转基因植株的
GUS
染色
X-Gluc (5
-
bromo
-
4chloro
-
3
-
indolyl-b-D-glucu-
ronic acid)
购自北京天根生化科技有限公司，配制方
法参考《现代植物生理学实验指南》。
100 mg Gluc
，
先溶于
1 mL
的
DMF
，取
80 mL 50 mmol/L
的磷酸钠
缓冲液
(pH 7.0)
，加入
1 mL 50 mmol/L
铁氰化钾、
1 mL
50 mmol/L
亚铁氰化钾和
2 mL 0.5mol/L EDTA (PH
8.0)
，再加入已溶解的
Gluc
，后加
20 mL
的甲醇，混
匀后分装保存。分别取分子检测为阳性的烟草及甘
薯转基因植株的根、茎、叶放入
GUS
染液内；同时
以未转烟草及甘薯植株作为阴性对照同样放入
GUS
染液中，
37
℃过夜，用无水乙醇和酒精脱色观
察染色结果。
作者贡献
张聪、郑雪莲、张婷是本研究的实验设计和实验研究
的执行人；蒲志刚完成项目的构思、试验结果分析与论文修