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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1049
-
1060
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1049
-
1060
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1053
总之，本研究提出了适于高梁
DNA
指纹图谱
库构建的一套核心引物，这批引物用于高粱
DNA
指纹图谱库构建是完全可行的，既为中国高粱品种
标准
DNA
指纹库构建奠定了基础，又为开展我国
高梁已知品种的
DNA
指纹图谱数据采集、品种权
纠纷和司法维权提供技术支撑。
3
材料与方法
3.1
供试材料
本实验收集由吉林省农业科学院作物育种研
究所、农业部植物新品种测试
(
公主岭
)
分中心等单
位提供的高粱材料共计
119
份
(
表
2)
。品种类型包括
地方品种、常规种
(
含有国外种质，下简称
F
；包括
保持系和恢复系，下分别简称
B
和
R)
和杂交种。
本实验搜集并选取分布在高粱
10
条染色体上
的
SSR
引物共计
288
对
(
表
3)
，其主要来源于法国
农业发展国际合作研究中心
(CIRAD)
、国际热带半
干旱地区作物研究所
(ICRISAT)
、中国农业科学院
(CAAS)
共同开发的
48
个
SSR
引物试剂盒，
Mace
等
(2009)
的高密度一致性连锁图谱以及
Mace
等
(2008)
等文献中所使用的。引物由北京三博远志公
司合成。
3.2 DNA
提取
本实验采用
CTAB
法
(
余传涨等
, 2010)
并进行
了适当的优化：
(1)
称适量样品，液氮下迅速磨成粉
末；
(2)
将粉末转入
2.0 mL Eppendorf
管中，加入
65
℃预热的
CTAB
缓冲液
700 µL
，并使其混匀；
(3)65
℃水浴加热
45 min
，不断地轻轻倒转摇动。水浴后，
取出离心管，冷却至室温；
(4)
通风橱下加入
700 µL
的氯仿
:
异戊醇
(24:1)
，轻轻倒转摇动
5~10 min
；
(5)
室温下
12 000 r/min
离心
10 min
，用去头枪尖将上
清转至一新
2.0 mL Eppendorf
管中；
(6)
加入
10 µL
RNA
酶溶液
(10 mg/mL)
，
37
℃下温浴
30 min
；
(7)
重复
4~5
步骤；
(8)
加入
-20
℃预冷的异丙醇或无水
乙醇于
2.0 mL Eppendorf
管中，轻轻混匀。-
20
℃冰
箱静置一段时间后，至
DNA
凝集，室温下钩出
DNA
；
(9) 76 %
乙醇洗涤两次，洗涤完毕后，将
DNA
晾干；
(10)
加入适量的
1×TE (PH 8.0)
溶解于试管中，
4
℃下保存备用。取
2
μ
L DNA
溶液，用
0.8%
的琼
脂糖凝胶电泳检测。
3.3 PCR
扩增
扩增体系：采用
10 µL
反应体系，其中含
1×PCR
Buffer
2+
(
含
2 mmol/L Mg
2+
)
，
100 µmol/L dNTP
，
0.24
µmol/L
SSR
引物，
0.4U
Taq
DNA
聚合酶，
20 ng
DNA
模板，其余用双蒸水补足。
扩增程序为
94
℃预变性
10 min
，
1
个循环；
94
℃变性
1 min
，
55
℃退火
1 min
，
72
℃延伸
1 min
，
共
36
个循环
(
根据引物特点可作适当调整
)
；最后
72
℃延伸
10 min
，
4
℃保存。扩增反应在
Bio-Rad
公
司
MyCycler™ PCR
仪上进行。
3.4
电泳检测
SSR
扩增产物在
6%
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
上分离。
70 W
预电泳
45 min
，
70 W
电泳
45 min
。
银染：将凝胶板置于
10%
醋酸溶液固定
20 min
；双
蒸水漂洗
3 min
；在
2 L
新配的染色液
(3 g AgNO
3
)
中染色
20~30 min
；双蒸水快速漂洗
1
次，时间不
超过
10 s
；
2 L
显影液
(25 g NaOH+7 mL
甲醛溶液
)
显影；
10%
醋酸溶液中定影
5 min
；双蒸水漂洗
5 min
后置于室温下自然晾干。
3.5
数据统计分析
SSR
扩增产物以
0
、
1
、
9
统计建立数据库。在
相同迁移率位置上，有带记为
1
，无带记为
0
，缺
失数据记为
9
。采用
Popgene1.32
软件
(Yeh et al.,
1999)
分别计算：
(1)
总等位变异数
(number of alleles,
na)
；
(2)
有效等位变异数
(effective number of alleles,
ne)
；
(3)Shannon-Weaver
指数
(Shannon’s information
index, I)
；
(4)
基因流
(gene flow, Nm)
；
(5)Nei
期望杂
合度
(expected heterozygosity, He)
；
(6)
多态性信息量
(polymorphism information content, PIC)
。
作者贡献
李晓辉和杨德光负责实验设计和论文修改；王凤华参与
实验设计和数据分析；郝彩环整理和收集实验材料；王晶和
张春宵是本研究的具体执行人，共同开展试验、数据分析和
论文写作。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由农业部
“DUS
测试品种、信息
DNA
测试技术
研究
”
项目
(200903008)
，
“DNA
指纹图谱鉴定技术方法研究
和数据采集
”
课题
(200903008-07)
，
“
高梁
DNA
指纹图谱鉴定
技术标准研制及数据库构建
”
子课题
(200903008-07-08)
资
助。感谢吉林省农业科学院作物育种研究所、农业部植物新
品种测试
(
公主岭
)
分中心等单位为本研究提供实验材料。感
谢匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。