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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1497
-
1504
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1497
-
1504
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1503
72
℃
2 min
，
34
个循环；最后再
72
℃延伸
10 min
。
PCR
产物电泳检测、回收、克隆、测序同
3.4
。
3.7
BnPPR636
基因的组织特异性表达分析
在植株生长期间分别提取根、茎、叶、花和发育
角果的总
RNA
，反转录成
cDNA
后，根据
Chai
等
(2010)
采用半定量法检测
BnPPR636
基因在不同组
织中的相对表达量，以甘蓝型油菜的看家基因
Bnactin
(GenBank
登录号
: AF1118122)
为内参进行
半定量
PCR
分析。引物组合如下：
PPR-ALONE-F
：
5'
-
AGATGGTGATACGAAGAACA
-
3'
，
PPR-ALONE
-R
：
5'
-
AAAAGGTTGAGGGCATCGTC
-
3'
；
Actin-F
：
5'
-
TCTGGCATCACACTTTCTACAACGAGC
-
3'
，
Actin-R
：
5'
-
CAGGGAACATGGTCGAACCACC
-
3'
。
3.8
启动子的扩增
利用油菜基因组
DNA
作为模板，使用
Genome-
walking
试剂盒
(Takara
公司
)
扩增油菜
BnPPR636
启
动子序列。根据
BnPPR636
的全长序列，设计
3
条引
物
SP1 (5'
-
TGGCAACTGAACCAAACAATC
-
3')
、
SP2
(5'
-
CCGAGGCTGAACCAATGCCAAAG
-
3')
和
SP3
(5'
-
TCCTTTTTCCTTAGGGCATAC
-
3')
。以试剂盒提
供的
AP2
引物作为上游引物，以
SP1
、
SP2
、
SP3
引
物分别作为下游引物进行
3
轮热不对称
PCR
反应。具
体
PCR
过程严格按照试剂盒说明进行。
PCR
产物电
泳检测、回收、克隆、测序同
3.4
。
作者贡献
梅德圣提出并设计本研究，胡琼和李云昌负责研究的
指导和材料提供，三位均参与论文写作与修改润色；彭鹏飞
负责具体试验的执行和初稿写作；刘道敏、付丽参加部分
PCR
试验，张洪参与生物信息分析和引物设计。全体作者都
阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家
863
计划课题
(2011AA10A104)
、国家支
撑计划课题
(2011BAD35B04)
和湖北省研究与开发项目
(2011
-
2015)
提供经费支持。
参考文献
Andrés C., Lurin C., and Small I.D., 2007, The multifarious roles
of PPR protein in plant mitochondrial gene expression,
Physiol. Plantarum, 129: 14-22 http://dx.doi.org/10.1111/j.1-
399-3054.2006.00766.x
Bentolila S., Alfonso A., and Hanson M.R., 2002, A pentatri-
copeptide repeat-containing gene restores fertility to cyto-
plasmic male-sterile plants, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99
(16): 10887-10892 http://dx.doi.org/10.1073/pnas.1023015-
99 PMid:12136123 PMCid:125068
Chai G., Bai Z., Wei F., King G.J., Wang C., Shi L., Dong C.,
Chen H., and Liu S., 2010,
Brassica
GLABRA2 genes:
analysis of function related to seed oil content and develop-
pment of functional markers, Theor. Appl. Genet., 120(8):
1597-1610 http://dx.doi.org/10.1007/s00122-010-1279-8 P-
Mid:20162256
Geddy R., and Brown G.G., 2007, Genes encoding pentatrico-
peptide repeat (PPR) proteins are not conserved in location
in plant genomes and may be subject to diversifying selec-
tion, BMC Genomics, 8: 130 http://dx.doi.org/10.1186/14-
71-2164-8-130 PMid:17521445 PMCid:1892557
Hao J.Y., Li Y.C., Hu Q., Mei D.S., Li Y.D., and Xu Y.S., 2011,
Putative fragment cloning of Nsa CMS restoration gene in
Brassica napus
, Zhongguo Youliao Zuowu Xuebao (Chinese
Journal of Oil Crop Sciences), 33(5): 433-437 (
郝建轶
,
李
云昌
,
胡琼
,
梅德圣
,
李英德
,
徐育松
, 2011,
油菜野芥细
胞质雄性不育恢复基因候选片段的克隆
,
中国油料作物
学报
, 33(5): 433-437)
He C.F., Liu L., Dong Y.M., Zhang S.P., Zhuang C.Y., Yao N.,
and Li L.B., 2011, Cloning and bioinformatic analysis of
lignin synthase gene in bamboo, Xibei Zhiwu Xuebao (Acta
Botanica Boreali-Occidentalia Sinica), 31(2): 273-279 (
何
聪芬
,
刘蕾
,
董银卯
,
张淑萍
,
庄彩云
,
姚娜
,
李潞滨
,
2011,
竹子木质素合成酶基因克隆与分析
,
西北植物学
报
, 31(2): 273-279)
Imai R., Koizuka N., Fujimoto H., Hayakawa T., Sakai T., and
Imamura J., 2003, Delimitation of the fertility restorer locus
Rfk1
to a 43 kb contig in Kosena radish (
Raphanus sativus
L.), Mol. Genet. Genomics, 269(3): 388-394 http://dx.doi.
org/10.1007/s00438-003-0847-x PMid:12712328
Klein R.R., Klein P.E., Mullet J.E., Minx P., Rooney W.L., and
Schertz K.F., 2005, Fertility restorer locus
Rf1
of sorghum
(
Sorghum bicolor
L.) encodes a pentatricopeptide repeat
protein not present in the collinear region of rice chromo-
some 12, Theor. Appl. Genet., 111(6): 994-1012 http://dx.
doi.org/10.1007/s00122-005-2011-y PMid:16078015
Komori T., Ohta S., Murai N., Takakura Y., Kuraya Y., Suzuki S.,
Hiei Y., Imaseki H., and Nitta N., 2004, Map-based cloning
of a fertility restorer gene,
Rf-1
, in rice (
Oryza sativa
L.),
Plant J., 37(3): 315-325 http://dx.doi.org/10.1046/j.1365-3-
13X.2003.01961.x PMid:14731253
Kotera E., Tasaka M., and Shikanai T., 2005, A pentatricopeptide
repeat protein is essential for RNA editing in chloroplasts,