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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1497
-
1504
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1497
-
1504
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1498
蛋白由多个含有
35
个氨基酸的
PPR
基序组成，每个
PPR
基序含有非常保守的氨基酸残基，如酪氨酸、
赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸等
(O'Toole et al., 2008)
。
基序的重复数目在
2
到
26
之间，一般为
12
个。
PPR
基
因序列比较简单，一般不含有内含子序列，或者含
有极少数目的内含子
(Andr
é
s et al., 2007)
。已鉴定的
PPR
蛋白中，大约有
50%
蛋白的
PPR
基序呈串连重复
排列。这些重复单元通过形成超螺旋而与单链
RNA
特异结合，在植物发育和细胞器的形成过程中发挥
重要的调控作用。
大多数
PPR
蛋白定位在线粒体和叶绿体，具有
细胞器定位信号肽，与细胞器基因表达密切相关。
前人研究表明
PPR
蛋白几乎参与线粒体基因表达的
所有阶段
(Schmitz-Linneweber and Small, 2008)
，如
RNA
剪切、编辑、
翻译以及稳定性，对植物的生
长发育尤其是逆境抗性和育性调控起关键作用
(Ko-
tera et al., 2005)
。
PPR
基因在不同的物种之间具有高
度同源性。在已克隆的植物细胞质雄性不育
(CMS)
的恢复基因中，绝大多数都为
PPR
基因
(Liu et al.,
2012;
郝建轶等
, 2011)
。
Geddy
和
Brown (2007)
通过
比较基因组学研究发现，与其它
PPR
蛋白相比，恢
复基因所编码的
PPR
蛋白表现出更高的同源性。这
一特征为进行与植物育性调控相关的
PPR
基因的克
隆提供了重要依据。
近年来，启动子序列的克隆与分析逐渐受到重
视。在基因的表达调控中，启动子作为基因表达的
顺式作用元件，起着十分重要的作用。研究启动子的
结构，可以推测目标基因的表达模式及功能。建立
在
PCR
技术基础上的染色体步移技术
(thermal asy-
mmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)
，以基因组
DNA
为模板，使用高退火温度及长的特异引物与低退火
温度及短的简并引物组合，通过高严谨性
PCR
和低
严谨性
PCR
交替进行热不对称循环，有效扩增特异
产物，具有简单快速、特异性高等特点，是扩增基
因侧翼序列的有效手段之一。当前，对于大多数生
物而言，全基因组序列不易获得，要从一个已知序
列中得到其两侧区域的
DNA
序列，染色体步移技
术是一个非常好的选择
(
徐超等
, 2011)
。染色体步
移技术利用已知序列设计
PCR
引物，扩增与目标片
段或区域相邻的未知序列或与其呈线性关系的未
知序列
,
在鉴定启动子序列、特定基因的上、下游序
列以及分析转基因过程中外缘基因的插入位点等
方面发挥了重要作用
(Liu et al., 1995; Liu and W-
ittier, 1995)
。
PPR
基因在植物
CMS
的育性调控中起着重要
作用。
Bentolila
等
(2002)
用图位克隆的方法克隆了矮
牵牛中的
CMS
育性恢复基因
Rf-PPR592
，其编码的
产物为含
14
个
PPR
基序的线粒体定位蛋白。
Imai
等
(2003)
克隆了萝卜
CMS
的恢复基因
Rfk1(Rfo)
，该基
因为含
16
个
PPR
基序的线粒体定位蛋白。
BT
型水稻
CMS
的恢复基因
Rf
-
1
(
PRR791
)
基因编码一个含
PPR
的线粒体定位蛋白
(Komori et al., 2004)
。高粱
CMS
的恢复基因
Rf2
也属于
PPR
蛋白家族基因，其
编码的
PPR
蛋白和水稻
Rf1
的
PPR
蛋白具有高度同
源性。
Xu
等
(2009)
在玉米中克隆了
5
个编码
PPR
蛋白
的基因
(
PPR
-
814a, PPR
-
814b, PPR
-
814c, PPR
-
816
和
PPR
-
817
)
，序列分析认为
S
型雄性不育细胞质的
育性恢复基因可能为
PPR
-
814a
、
PPR
-
814b
和
PPR
-
814cq
这三者中的一个
(Klein et al., 2005)
。本研究通
过进化分析，根据
PPR
蛋白的保守性利用简并引物
设计软件
CODEHOP (Liu and Huang, 1998)
设计引
物，扩增甘蓝型油菜
PPR
基因的同源片段，结合
RACE (Rose et al., 1998)
技术克隆甘蓝型油菜
Bn
-
PPR636
基因的全长
cDNA
序列和基因组序列，并结
合染色体步移技术，采用
TAIL-PCR
获取启动子序
列；利用生物信息学软件分析启动子序列的顺式作
用元件，推导可能的激活位点，为研究甘蓝型油菜中
PPR
基因的作用与功能、鉴定油菜
CMS
育性恢复基
因奠定基础。
1
结果与分析
1.1
BnPPR636
基因片段的克隆
采用
CODEHOP
设计的引物进行组合配对，获
得
9
个引物组合。经
PCR
扩增与筛选后，发现引物组
合
MOTIF-E
-
1
：
TGCTTCTGCTATGGACCTGCTNM
GNAARATGG
与
MOTIF-I
-
10
：
TGACAGCTGACA-
GCTGACAGAANCCNTGDAT
扩增效果最好，获得
长度约为
550 bp
的特异性条带
(
图
1)
。测序结果表
明所得片段大小为
554 bp
，与拟南芥
AtPPR
基因
(At1-
g12300)
具有非常高的相似性。在
E
值为
2e
-142
下，核
苷酸序列的一致性达到
77%
；与萝卜中一个与育性
恢复有关的
RAPD-PCR
标记
(AB458521)
在
E
值为
2e
-116
下一致性为
84%
，证明该片段为甘蓝型油菜的
PPR
基因片段。