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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1438
-
1446
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1438
-
1446
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1445
1/2MS
培养液进行水培培养
(16 h
光照
/8 h
黑暗
)
。当
幼苗生长至三叶期，移至塑料培养瓶，用
200 mmol/L
NaCl
、
200 μmol/L ABA
和
25% PEG6000
分别处理
40 h
、
40 h
和
16 h
，黄化苗的获得则通过暗培养至三
叶期幼苗完全出现黄化。所有样品液氮速冻后贮存
于-
80
℃下用于
RNA
提取。
3.3
定量
RT-PCR
引物的设计
使用引物设计软件
Primer Premier 5.0
对
30
个
OsDof
基因进行荧光定量引物设计并送往广州英伟
创津公司进行合成。本实验用的荧光定量引物序列
如表
1
所示。
3.4
水稻总
RNA
的提取及反转录
水稻总
RNA
的提取采用
RNAsimple Total RNA
Kit (
天根
)
，经
Dnase
Ⅰ
(TakaRa
公司
)
处理后，用
RNA-
clean Kit (
天根
)
纯化。通过琼脂糖凝胶电泳检测，
选取具有清晰
18S
和
28S
带的总
RNA
用于反转录，即
cDNA
第一链合成，使用
Promega A3500
试剂盒。具
体方法按试剂盒说明书进行，然后保存于-
20
℃备用。
3.5
定量
RT-PCR
定量
RT-PCR
反应使用罗氏公司的
SYBR Green
法荧光定量试剂盒。
20 μL
反应体系包含：
1 μL
反转
录产物，
10 μL Faststart Univeral SYBR Green Master
(ROX)
及
10 μmol/L
的上下游引物各
0.6 μL
。定量
PCR
在
ABI7500
定量
PCR
仪
(Applied Biosystems,
美国
)
上进行，采用
2
-△△CT
相对定量的方法进行表达量的比
较。运行的反应程序为：
95
℃
10 min
；
95
℃
15 s
，
60
℃
(
或
64
℃
) 1 min
，
40
个循环；
60
℃收集荧光。定
量
PCR
反应利用
Actin
基因作为内参。
作者贡献
周淑芬和颜静宛是本研究的实验设计和实验研究的执
行人，周淑芬完成数据分析和论文初稿的写作；刘华清、林
智敏、陈睿和杨绍华参与实验设计，试验结果分析；王锋是
项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写
作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由福建省自然科学基金项目
(2009J01091)
和福建
省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队项目
(CXTD-
2011
-
09)
共同资助。
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