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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1422
-
1430
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1422
-
1430
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1428
DNA (Murray and Thompson, 1980)
3.2.2 PCR
扩增
AGPsma
的
PCR
扩增引物来自于文献
(
田志喜
等
, 2010)
。引物序列为
F
：
5'
-
TACGCTATGCTCTTG-
AAAC
-
3'
，
R
：
5'
-
TATCTTCCCAGTAACCATC-A
-
3'
。
引物
PCR
反应体系：
20 µL
总体积中包含
DNA
模板，
10
×
PCR Buffer
，
dNTP (2.5 mmol/L)
，
20 pmol
引物
(20~40 ng)
，
Taq
E (5 U/µL)
，加水至
20 µL
。
PCR
反
应条件：首先
94
℃预变性
4 min
；然后
94
℃变性
1 min
，
58
℃退火
30 s
，
72
℃延伸
30 s
，
45
个循环；最后
72
℃
延伸
10 min
。
PCR
扩增产物用
2%
琼脂糖凝胶电泳进
行分离，照相。
3.3 PCR
产物的克隆与测序
克隆测序的
DNA
分别来自元江的普通野生稻
(
以下简称元江野生稻
)
、籼稻品种
93
-
11
、籼粳交偏
粳品种南
34
以及粳稻品种榆密
15
的
PCR
产物。使
用琼脂糖
DNA
回收试剂盒回收目的片段，取
2 µL
回
收产物和
1 µL
pEASY
TM
-T1 Smiple Cloning Vecto
及
2 µL ddH
2
O
室温下连接
10 min
。加连接产物于
50 µL
的
Trans1
-
T1
感受态细胞中转化，菌落
PCR
检测阳性，
将阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。同一
目的
PCR
片段选取
6
个克隆，用通用引物
M13
测序。
3.4
数据分析
序列比对在
NCBI
网站
(http://www.ncbi.nlm.nih.
gov)
上进行、用
DNAMAN
软件分析材料间
DNA
片
段序列差异并对供试材料进行聚类分析。以元江野
生稻、
93
-
11
、南
34
和榆密
15
作为基本参照，对
AGP
-
sma
引物在所有的
225
份材料中扩增出的条带进行
统计分析。
作者贡献
赵颖和谭学林是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；赵颖和朱高倩完成数据分析，论文初稿的写作；孙朝华
参与
DNA
的提取，金寿林参与实验材料的种植和管理工作；
谭学林是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，
论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由云南省科技攻关重点项目
(2009BB007)
资助。
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-
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