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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1414
-
1421
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1414
-
1421
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1418
图
6
不同物种
ZDS
蛋白的系统进化树分析
注
: 1:
甘蓝型油菜
; 2:
大白菜
; 3:
拟南芥
; 4:
番木瓜
; 5:
无
花果
; 6:
黄瓜
; 7:
南瓜
; 8:
草莓
; 9:
苹果
; 10:
麻风树
; 11:
柚
; 12:
葡萄柚
; 13:
温州蜜柑
; 14:
甜橙
; 15:
向日葵
; 16:
万
寿菊
; 17:
胡萝卜
; 18:
黄龙胆
; 19:
番薯
; 20:
甜椒
; 21:
烟草
;
22:
番茄
; 23:
黄水仙
; 24:
中国水仙
; 25:
文心兰
; 26:
小麦
;
27:
大麦
; 28:
高粱
; 29:
玉米
;
树枝长度代表以邻接法估算
出来的遗传距离
,
树的分支程度根据
1 000
次重复的自展率
Figure 6 Phylogenetic analysis of ZDS protein in different species
Note: 1:
Brassica napus
|G3dr91|; 2:
Brassica rapa
subsp.
pekinensis
|B9VUW3|; 3:
Arabidopsis thaliana
|Q38893|; 4:
Carica papaya
|C1KC69|; 5:
Ficus carica
|G9JNC6|; 6:
Cucumis
sativus
; 7:
Cucubita moschata
|G1FQQ9|; 8:
Fragaria ananassa
|C7T0M6|; 9:
Malus domestica
|Q5W5X6|; 10:
Jatropha curcas
|C7F6Z1|; 11:
Citrus maxima
|B3VSF5|; 12:
Citrus paradisi
|Q93Y81|; 13:
Citrus unshiu
|Q2PPX8|; 14:
Citrus sinensis
|Q8VXN4|; 15:
Helianthus annuus
|Q8H0Q6|; 16:
Tagetes
erecta
|Q9FV46|; 17:
Daucus carota subsp. sativus
|Q2VEX8|;
18:
Gentiana lutea
|Q1XIT4|; 19:
Ipomoea
sp.
Kenyan
|D0FZ28|; 20:
Capsicum annuum
|Q9SMJ3|; 21:
Nicotiana
tabacum
|F6N7C2|; 22:
Solanum lycopersicum
|Q202I0|; 23:
Narcissus pseudonarcissus
|O49901|; 24:
Narcissus tazetta
var.
chinensis
|B2LS46|; 25:
Oncidium Gower Ramsey
|C3VEQ0|;
26:
Triticum aestivum
|F8SZ85|; 27:
Hordeum vulgare
var.
distichum
|F2DMF6|; 28:
Sorghum bicolor
|A9UKC6|; 29:
Zea
mays
|B6UBK2|; The branch lengths are proportional to the
genetic distances as estimated by the neighbor-joining method,
this study employed 1 000 bootstrap replication
3.2
黄瓜
RNA
提取及
cDNA
克隆
选取
BN35
转色期果实
(
授粉后
40 d)
，将果肉
切成薄片，液氮速冻。采用
TransGen
EasyPure
TM
Plant RNA Kit
试剂盒提取
RNA
，具体操作按照说
明书进行，所提取的
RNA
经过
1%
琼脂糖凝胶电泳
检测后进行逆转录反应。逆转录试剂盒
SuperScript
Ⅲ
First-Strand Synthesis System for RT
购自
Invitrogen
公司，以提取的总
RNA
为模板，按照说明书逆转录
为
cDNA
。
以黄瓜全基因组数据库注释的
Zds
序列为参
考，在开放阅读框之外设计一对特异引物，
ZdsF
：
5'
-
ATCCATTCCTTTGTTCT
-
3'
；
ZdsR
：
5'
-
CACTAT-
GCCTCTGTGTTAC
-
3'
，以
cDNA
为模板进行
PCR
扩增。
PCR
所用的酶购自
TransGen
公司，
PCR
体
系：
10
×
TransStart Taq
Buffer 2.5 mL (
含
20 mmol/L
Mg
2+
)
，
2.5 mmol/L dNTPs 2 µL
，
TransStart
TM
Taq
DNA Polymerase 0.5 µL
，
10 µmol/L
上游引物
0.5 µL
，
10 µmol/L
下游引物
0.5 µL
，
cDNA
模板
(20 ng/µL)
2 µL
，加
ddH
2
O
补足到
25 µL
。
PCR
反应程序：
94
℃，
5 min
，变性
94
℃，
30 s
；退火
56
℃，
30 s
，延伸
72
℃，
2 min
，共
35
个循环，最后
72
℃延伸
10 min
，
4
℃冰
箱保存。
PCR
产物经
1%
琼脂糖凝胶电泳检测，采用
天根普通琼脂糖凝胶
DNA
回收试剂盒
(
离心柱型
)
按照说明进行回收，回收产物连入
pEASY
-T1 Clon-
ging Vector
，转化
Trans1
-
T1
感受态细胞，连接载体
和感受态均购自于
TransGen
公司。蓝白斑筛选阳性
克隆，经菌液
PCR
检测后，将阳性重组子送到中国
农业科学院作物科学研究所重大科学工程楼开放
实验室测序。
3.3
CsZds
基因序列特征分析及系统进化树构建
采用
Expasy
网站
ProtParam
程序分析编码氨基
酸的组成、分子量、理论等电点等理化性质，
TMH-
MM Server 2.0
分析跨膜区，
ProtScale
分析蛋白的
亲水性、疏水性，
TargetP 1.1 Sever
预测蛋白的导肽，
蛋白质的二级结构通过
SOPMA
在线分析获得，
CDD
(conserved domain database)
进行氨基酸序列结构域
分析，
CsZds
基因开放阅读框的分析、相应编码氨
基酸序列的推导和多重序列比对均采用
DNAMAN
软件完成，
MEGA4.0
软件进行同源性分析，并用邻
接法
(neghbor-joining, NJ)
构建系统进化树，所用
ZDS
蛋白序列来自
SWISSPORT
数据库。
3.4
CsZds
基因表达分析
分别提取西双版纳黄瓜
(BN35) 6
个不同时期的