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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1414
-
1421
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1414
-
1421
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1415
(Palozza et al., 2002; Müller et al., 2002)
。近年来，人
们已从分子遗传和生理生化等方面对
β
-胡萝卜素
生物合成途径的酶进行鉴定，并从分子水平对类胡
萝卜素的主要生物合成途径进行了明确的阐述
(Hir-
schberg, 2001; Fraser and Bramley, 2004; Romer and
Fraser, 2005; DellaPenna and Pogson, 2006; Howitt
and Pogson, 2006)
，为研究西双版纳黄瓜类胡萝卜素
积累提供了重要参考。
ζ
-胡萝卜素脱氢酶
(ζ
-
Carotene desaturase, ZDS)
是类胡萝卜素生物合成途径中的重要去饱和酶之
一。它催化
ζ
-胡萝卜素发生两次脱氢反应，首先生
成途径中的第一个有色分子—链孢红素，然后经过
进一步催化作用转化成番茄红素，番茄红素是类胡
萝卜素代谢途径的分歧点。目前已从胡萝卜、草莓、
文心兰、甜橙、玉米等多种植物中克隆到
Zds
基因，
在甜瓜属中对该基因的分离和鉴定尚未见报道。
本研究以西双版纳黄瓜为试材，克隆其果肉中
CsZds
基因进行相关序列分析，并研究该基因在转
录水平的表达调控，旨在为探索西双版纳黄瓜果实
类胡萝卜素积累的分子机制奠定基础，同时也为黄
瓜营养品质的改良提供科学依据。
1
结果分析
1.1
CsZds
基因
cDNA
序列的克隆
以
ZdsF/ZdsR
为引物进行
PCR
特异扩增，获得
约
1.8 kb
的特异产物
(
图
1)
。对该片段进行回收纯化，
连接到
pEASY
-T1
载体上，筛选阳性重组子测序鉴定，
该克隆片段长
1 805 bp
，为
CsZds
目标片段。
图
1
CsZds
基因的
PCR
扩增及检测结果
注
: M:
天根
marker
Ⅲ
; A: cDNA
扩增产物
Figure 1 The PCR amplification and detection results of
CsZds
gene
Note: M: TIANGEN marker
Ⅲ
; A: cDNA amplification product
1.2
CsZds
基因的序列分析
核苷酸测序结果显示，所得片段具有完整的开
放阅读框，位于
31~1 761 bp
，编码
576
个氨基酸
(
图
2)
。推测蛋白质的相对分子式为
C
2879
H
4520
N
766
O
837
S
23
，
原子数为
9 025
，相对分子质量为
63 993.5
，理论等
电点为
6.77
，不稳定系数为
40.11
，属于不稳定蛋白。
采用
ProtScale
对
CsZDS
蛋白质的疏水性进行
分析
(
图
3)
，整体来看，亲水性氨基酸和疏水性氨基
酸在整个蛋白质中的分布均匀，无明显的疏水区。
TMHMM Server 2.0
也并未预测到跨膜结构，推测
该酶在黄瓜中可能不是膜结合蛋白。
导肽引导新合成的肽链进入细胞器，对于了解
蛋白质的亚细胞定位与作用机制有一定意义，应用
TargetP 1.1 Server
预测
CsZDS
氨基酸序列导肽
(
表
1)
，
结果表明，该序列含有叶绿体转运肽。
蛋白质的多肽链通过折叠、螺旋、和卷曲形成比
较稳定的空间结构，依据
Geourjon
和
Deléage (1995)
的方法，用
SOPMA
预测
CsZDS
氨基酸多肽链的二
级结构
(
图
4)
，发现无规则卷曲最多，为
42.19%
，分
布较为均匀；其次是
α
-螺旋，为
37.85%
，主要集中在
中部，延伸链为
14.93%
，
β
-转角最少，为
5.03%
，这
4
个二级结构构成
CsZDS
蛋白的基本结构。
对推测的
CsZDS
氨基酸序列进行
CDD (con-
served domain database)
搜索，
32~569
位氨基酸区域
与
ζ
-胡萝卜素脱氢酶蛋白域
(PLN02487)
高度同源，
表明
CsZds
基因是
ζ
-胡萝卜素脱氢酶，而且
76~142
位含有
NADB-Rossmann superfamily
保守结构域，说
明该酶可能与
NADP(H)
等辅助因子相互作用
(
图
5)
。
1.3
CsZDS
同源性分析和系统发育树构建
通过
SWISSPORT
数据库检索
ZDS
在不同植物
中的蛋白序列，发现该蛋白在自然界广泛存在，
ZDS
催化合成类胡萝卜素是不同物种共同拥有的生物
途径。将检索到的南瓜、水仙、番茄等
28
种植物的
ZDS
氨基酸序列及
CsZDS
推导的氨基酸序列利用
MEGA4.0
软件构建系统进化树
(
图
6)
，
ZDS
蛋白分
为两大类群，系属于单子叶植物和双子叶植物，同一
科属物种的
ZDS
蛋白位于系统进化树的相同分支
上，亲缘关系越近，相似系数越高，
ZDS
蛋白的进
化与植物进化基本一致。推导的
CsZDS
氨基酸序
列与同属葫芦科的南瓜序列进化关系最为相近，与
小麦、玉米、文心兰等进化关系相对较远。
利用
DNAMAN
软件对黄瓜、南瓜、向日葵、胡
萝卜、甜橙、草莓、番茄、拟南芥、玉米等
9
个物不
同物种中
ZDS
蛋白的同源性较高，仅在氨基端和羧
基端的氨基酸呈现多样性的变化，氨基端的变化较
为明显
(
图
7)
。
CsZDS
氨基酸序列中存在
ζ
-胡萝卜