Basic HTML Version
分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1025
-
1031
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1025
-
1031
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1029
3.2.2
甘露糖筛选的敏感性问题
在细胞代谢的过程中，
6-
磷酸甘露糖的积累，
磷酸根离子和
ATP
的消耗等问题会导致培养基的
酸化。同时，还有细胞内其他糖类代谢等生理因
素的影响，会使得外植体对甘露糖的敏感性有所
下降。
另外，笔者认为植物对甘露糖的敏感性与外植
体的生理状况密切相关。如笔者在实验中发现，菊
花的零代组培苗与高代组培苗对甘露糖的敏感度
存在较大差异：以叶盘分化率作为拐点，零代组培
苗的临界筛选浓度为
8 g/L
甘露糖
,
而高代组培苗临
界筛选浓度仅为
4 g/L
。
3.3.3
甘露糖的临界筛选浓度差别较大
&
筛选时间
问题
在不同的植物种类中，甘露糖的临界筛选浓度
一致性不高且差别很大。如仅在建立了甘露糖选择
体系的植物种类中，就可在甜菜中
1.5 g/L (Joersbo
et al., 1998)
至甜橙中
25 g/L(
曾黎辉等
, 2008)
的大范
围内浮动，相差
16.67
倍之多。因此，在新的植物
种类中开发甘露糖选择体系时，需要设置跨越范围
较大的梯度实验来摸索最佳的临界筛选浓度。
除了甘露糖筛选浓度和多步筛选以外，杨彩云
等在实验中还注意到了最佳筛选时间的问题，如时
间长了即使是长势好的外植体也会慢慢出现黄化。
这是因为刚开始在筛选压下，即使是阳性植株也不
可能完全抵抗甘露糖，只有经过几轮的筛选得到纯
合体，才能真正成为抗性苗
(
杨彩云等
, 2009)
。笔者
认为这是一个值得注意的问题，但是在已应用甘露
糖筛选系统的转基因报道中，筛选时间的问题并没
有得到充分的认识。
3.3.4
甘露糖筛选的假阳性比例较大
在对甘露糖敏感的植物中，与卡那霉素选择体
系相比，甘露糖安全选择体系的转化效率要高出数
十倍，但同时也增加了假阳性的比例。根据曾藜辉
(2008)
等的雪柑实验，生长健壮的转化苗周围分化
出的丛生芽有很高的假阳性比例。
台湾研究者
Chen
等
(2010)
曾在尝试将赖氨酸
作为转基因筛选剂的文章中提到，对新的转基因选
择体系来说，生根的植株很有可能不是假阳性，而
是真的转化苗。因为在外植体的接种、分化不定芽
和生根的几个阶段里，生根很可能个决定因素。
笔者认为，对甘露糖选择体系来说，可以综合
利用形态、生化鉴定和分子鉴定的方法来提高转基
因阳性苗的鉴定效率：选取筛选培养基上的生根
苗，先做氯酚红的生化反应鉴定，然后取
pH
值有
所下降的转化苗做分子鉴定，
PCR
或
Southern
等方
法均可。鉴定完成之后，可以继续做表达分析，如
表达部位的确定，实时表达量分析，以及
PMI
蛋白
含量测定等工作，来解决
pmi
基因在哪里表达，何
时表达，表达了多少等问题。
作者贡献
第一作者孙佳琦在对转基因菊花的甘露糖安全筛选的
实验基础上，完成文献的查阅、分析、比较和总结，并负责
论文的写作与修改。本文通讯作者为张启翔。全体作者都阅
读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家
863
计划
(2011AA100208)
资助。
参考文献
Aswath C.R., Mo S.Y., Kim D.H., and Park S.W., 2006,
Agrobacterium
and biolistic transformation of onion using
non-antibiotic selection marker phosphomannose isomerase Vol.
25, Springer, pp. 92-99.
Boscariol R.L., Almeida W.A.B., Derbyshire M., Mourao F.A.A.,
and Mendes B.M.J., 2003, The use of the PMI/mannose
selection system to recover transgenic sweet orange plants
(
Citrus sinensis
L. Osbeck) Vol. 22, Springer, pp.122-128
Chen I-Chieh, Thiruvengadam V., Lin W.D., Chang H.H., and
Hsu W.H., 2010, Lysine racemase: a novel non-antibiotic
selectable marker for plant transformation, Plant Mol Biol.,
72: 153-169
Da Silva J.A.T., 2004, Evaluation of carbon sources as positive
selection agents for chrysanthemum (Dendranthema x
grandiflorum) transformation, New Zealand Journal of
Crop and Horticultural Science, 32: 55-67
Degenhardt J., Poppe A., Montag J., and Szankowski I., 2006,
The use of the phosphomannose-isomerase/mannose selection
system to recover transgenic apple plants, Plant Cell
Reports, 25: 1149-1156
Ding Z.S., Zhao M., Jing Y.X., Li L.B., and Kuang T.Y., 2006,
Efficient
Agrobacterium
-mediated transformation of rice
by phosphomannose isomerase/mannose selection, Plant
Molecular Biology Reporter, 24: 295-303
Gadaleta A., Giancaspro A., Blechl A., and Blanco A., 2006,
Phosphomannose isomerase, pmi, as a selectable marker
gene for durum wheat transformation Vol. 43, Elsevier,
pp.31-37