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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1252
-
1258
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1252
-
1258
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1257
学院蔬菜研究所，具体编号及来源见表
2
。
3.2 DNA
提取
取刚展开的幼嫩叶片，采用
CTAB
法
(
谢大森等
,
2010)
提取基因组
DNA
。
3.3 ITS
序列的
PCR
扩增
ITS
全序列
(
包括
ITS1, 5.8S rRNA, ITS2)
采用双
引物扩增。两引物分别为：
5'
-
CCTTATCATTTAGA-
GGAAGGAG
-
3' (Stanford et al., 2000)
；
5'
-
TCCTC-
CGCTTATTGATATGC
-
3' (White et al., 1990)
。
PCR
扩增反应总体积为
20 µL
，反应体系为：
20 ng DNA
模板，
50 ng
正反向引物，
2.5 mmol/L
的
dNTPs
，
2.5 mmol/L MgCl
2
，
2 µL 10
×
PCR buffer
和
1 U Taq
DNA
聚合酶
(TaKaRa)
。扩增程序为：
94
℃
5 min
；
94
℃
30 s
，
56
℃
1 min
，
72
℃
1 min
，
35
个循环；
72
℃
10min
。
3.4
目的片段回收及测序
利用琼脂糖凝胶上检测
PCR
产物，目的片段切
下后用琼脂糖凝胶
DNA
回收试剂盒
(
康为世纪
)
回
收。回收产物经纯化后连接于
pMD19
-
T
载体
(TaKaRa)
上，随后加入含有大肠杆菌
DH5α
感受态
细胞的
1.5 mL
离心管中，
37
℃静置培养过夜后，挑
取单克隆，并在
LB
液体培养基
(
含有
100 mg/L
氨
苄青霉素
)
中振荡过夜。利用菌液
PCR
方法鉴定阳
性克隆。测序由上海英俊生物技术有限公司完成。
3.5
序列分析
分析
ITS
测序结果，确定
ITS1
、
ITS2
和
5.8S
rRNA
区，所得序列采用
Clustal X 1.83
进行排序，
用
Bio XM 2.6
进行
GC
含量分析，碱基替换的同质
性检测用
MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011)
进行。利
用
MEGA 5.05
软件构建邻接树
(Neighbor-joining
tree)
和最大简约树
(Maximum parsimony tree)
，以自
展法
(bootstrap)
进行检测，共循环
1 000
次。西瓜
(
Citrullus lanatus
)
与冬瓜同属葫芦科，且亲缘关系较
近
(Kocyan et al., 2007)
，因此选该种为外根群进行
分析
(
登录号为
FJ915098)
。由于
ITS1
和
ITS2
的变
异都很小，因此聚类分析时把
ITS1
和
ITS2
结合在
一起计算。
作者贡献
谢大森和江彪是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；江彪和刘文睿完成数据分析，论文初稿的写作；何晓明
参与实验结果分析和论文的修改；彭庆务和赵芹提供实验材
料。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
感谢现代农业产业技术体系建设专项
(CARS
-
25
-
G
-
36)
，
广东省科技计划项目
(2011A020201002)
，广州市科技计划项
目
(20110000003)
给予本试验的经费支持。
参考文献
Bellarosa R., Simeone M.C., Papini A., and Schirone B.,
2005, Utility of ITS sequence data for phylogenetic
reconstruction of Italian
Quercus
spp., Mol. Phylogenet.
Evol., 34(2): 355-370 http://dx.doi.org/10.1016/j.ympev.
2004.10.014 PMid:15619447
Chen S.F., Dong S.S., Wu W., Shi S.H., and Zhou P.H., 2007,
Phylogenetics of
Triarrhena
and related genera based on
ITS sequence data, Wuhan Zhiwuxue Yanjiu (Journal of
Wuhan Botanical Research), 25(3): 239-244 (
陈少风
,
董
穗穗
,
吴伟
,
施苏华
,
周朴华
, 2007,
基于
ITS
序列探讨
荻属及其近缘植物的系统发育关系
,
武汉植物学研究
,
25(3): 239-244)
Gao Y.M., Zhang S.J., Zhang S.F., Li F., Wang X.W., Wu J.,
and Sun R.F., 2009, ITS analysis of
Brassica rapa
,
Zhongguo Shucai (China Vegetables), 24: 13-18 (
高玉梅
,
张淑江
,
章时蕃
,
李菲
,
王晓武
,
武剑
,
孙日飞
, 2009,
白菜类作物
ITS
序列分析
,
中国蔬菜
, 24: 13-18)
Kocyan A., Zhang L.B., Schaefer H., and Renner S.S., 2007, A
multi-locus chloroplast phylogeny for the Cucurbitaceae and
its implications for character evolution and classification,
Mol. Phylogenet. Evol., 44(2): 553-577 http://dx.doi.org/
10.1016/j.ympev.2006.12.022 PMid:17321763
Kress W.J., Liu A.Z., Newman M., and Li Q.J., 2005, The
molecular phylogeny of
Alpinia
(Zingiberaceae): a
complex and polyphyletic genus of gingers, Am. J. Bot.,
92(1): 167-178 http://dx.doi.org/10.3732/ajb.92.1.167
PMid:21652395
Shi Q.L., Zhuge Q., Huang M.R., and Wang M.X., 2001,
Phylogenetic relationship of
Populus
sections by ITS
sequence analysis, Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Sinica),
43(3): 323-325 (
史全良
,
诸葛强
,
黄敏仁
,
王明庥
, 2001,
用
ITS
序列研究杨属各组之间的系统发育关系
,
植物学
报
, 43(3): 323-325)
Song S.W., Li Z., Liu H.C., Sun G.W., and Chen R.Y., 2010,
RAPD analysis of genetic diversity of wax gourd and
Chieh-qua germplasm, Zhongguo Shucai (China
Vegetables), 22: 47-53 (
宋世威
,
李珍
,
刘厚诚
,
孙光闻
,
陈日远
, 2010,
冬瓜和节瓜种质资源遗传多样性的
RAPD
分析
,
中国蔬菜
, 22: 47-53)
Stanford A.M., Harden R., and Parks C.R., 2000, Phylogeny
and biogeography of
Juglans
(Juglandaceae) based on