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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1235
-
1245
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1235
-
1245
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1236
1
核桃基因的克隆研究
1.1
苯丙氨酸解氨酶
(
PAL
)
基因
苯丙氨酸解氨酶
(PAL, E.C4.3.1.5)
是催化苯丙
烷代谢途径第一步反应的酶，也是这个途径的关键
酶和限速酶。苯丙烷类途径生成的黄酮、类黄酮、
木质素和生物碱等次生代谢在植物的生长发育过
程中起着重要的作用，所以
PAL
对植物的生理意义
非常重大。王燕等
(2008)
根据
PAL
基因设计兼并引
物，克隆得到核桃苯丙氨酸解氨酶
(
PAL
)
基因
cDNA
片段，并命名为
JrPAL
，
Genbank
登录号为
AY747676
。
JrPAL
长
866 bp
，编码
289
个氨基酸。
通过核苷酸和蛋白质序列多重比较，发现
JrPAL
与
其他植物的
PAL
基因高度同源。
Claudot
等
(1993)
研究表明，
PAL
活性与杂种核桃
(
Juglans nigra
L.
×
Juglans regia
L.)
插条的生长率之间存在一定的
比例关系。通过克隆
JrPAL
，研究人员获得了调控
核桃黄酮化合物的代谢基因资源，在此基础上借助
转基因技术研究其表达调控机理，从而揭示其在核
桃插条生长过程中所起的作用。
1.2
水通道蛋白
(
CcPIP
)
基因
植物
CcPIP
是调节水分在细胞间以及植物整个
体内水平衡的分子基础，这类蛋白在植物的各种组
织大量存在，通过与其他物质成分的集合形成特异
的水分运输通道，有助于水分的长距离运输和细胞
内外的跨膜水分运输。艾雪等
(2009)
以山核桃
(
Cara
cathayensis
Sarg.)
为材料，利用
cDNA
末端快速扩增
技术
(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)
技
术克隆出山核桃水通道蛋白
(
CcPIP
)
的基因全长，并
应用
BLAST
软件进行序列同源行分析，结果显示
核桃
CcPIP
基因与多种水通道蛋白植物的氨基酸序
列具有较高的同源性，其中与葡萄和菜豆的同源性
最高为
99%
。这项研究结果从分子水平为研究山核
桃嫁接成活过程中水分的运输提供理论支持，对于
揭示
CcPIP
基因在山核桃接穗和砧木连接成活过程
中的相关功能和水分运输途径提供物质基础。
1.3
成花基因
He
等
(2011)
利用
RT-PCR
和
RACE
技术从核桃
早实品种
“
中林
5
号
”
花芽中克隆出
LEY
基因的同源
基因
JrLFY
(Genbank
登录号
: GU194836)
，
cDNA
序
列大小为
1 496 bp
，其中开放阅读框
(ORF)
为
1 158
bp
。与其相应的基因组序列
(Genbank
登录号
:
HQ019159)
显示，
JrLFY
包含
3
个外显子和
2
个内
含子，推测编码
385
个氨基酸，并含有与其他
LEY
同系物相应序列的
C
末端保守区域。
LEY
系统进化
树黄表明，核桃的
LEY
蛋白与山核桃、栗树相应
蛋白相似。这项研究为了解核桃早实性机制提供了
基础条件，为下一步将
JrLFY
基因导入晚实核桃做
准备。黄有军等
(2009)
利用互补脱氧核苷酸扩增片
段长度多态性
(cDNA-AFLP)
技术从山核桃中克隆
成花相关的特异基因片段
(TDFs)
，经测序和序列同
源性分析，其中
65
个
TDFs
为未知基因序列，
213
个
TDFs
具有同源序列，其功能涉及激素合成、
酶合成、细胞信号转导、叶绿素合成和光诱导等。
李敏
(2009)
以早实核桃花芽为材料，利用同源序列
法克隆出
jrAP1
(
jrAPATALLA1
)
基因全序列和
jrSEP1
(
jrSEPALLATA1
)
、
jrNEF1
(
jrNO EXINE
FORMATION 1
)
基因的部分片段，序列分析表明
jrAP1
与白桦、桉树的
MADS-box
基因具有较高的
同源性
(
分别为
76%, 62%)
，归入
MADS-box
基因家
族
AP1
亚家族；
jrSEP1
基因与板栗、大豆、桃树的
MADS-box
基因具有较高的同源性
(
分别为
92%,
92%, 88%)
，归入
MADS-box
基因家族
SEP1
亚家
族；
jrNEF1
与调控葡萄、杨树、拟南芥花粉壁形成
的基因具有较高的同源性
(
分别为
88%, 83%, 89%)
，
是调控花粉壁形成的一类基因。
Breton
等
(2004)
利
用体胚再生获得早实核桃苗，并从中克隆出调控花
芽分化的基因
AGAMOUS
(
AG
)
和
APETALA3
(
AP3
)
的同源基因，被命名为
jrAG
和
jrAP3
，分别属于
MADS-box
基因家族的
AG
亚家族和
AP1
亚家族。
APETALA3
(
AP3
)
和
AGAMOUS
(
AG
)
都是决定花器
官形成的基因。
1.4
早实基因
在普通核桃中存在着一类播种
1~2
年后就能开
花结实的早实类群。早实核桃的童期
(
幼年阶段
)
大
大缩短，这一特性在核桃的栽培和育种实践中具有
重要的意义。研究者利用分子生物学技术寻找与核
桃早实性状相关的基因研究。奚声珂
(1987)
通过对
我国核桃属的优良品种早实核桃的杂交试验研究，
初步认定核桃的早实性状是由两对以上的等位基
因决定的显性性状。杨克强等
(2002)
利用
RAPD
分
子标记技术获得与核桃早实基因连锁的特异标记
OPB
-
08
900
，完成了对早实基因的定位，为下一步
早实基因的克隆奠定了基础。王国安等
(2004)
以早
实核桃和晚实核桃类群为试材，参照分群法
(Bulked
Segregant Analysis, BSA)
，运用
RAPD
技术初步确