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孙晓宇等
, 2011,
不同保存
条件下五种大型海藻的
DNA
提取和
PCR
分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.95 pp.1680-1691 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0095)
1681
中含有的硫酸基多糖更易水溶，使溶液高度粘稠，
在
DNA
提取中很难去除，同时，这种酸性多糖会抑
制限制性酶切反应和
PCR
扩增
(Hong et al., 1995)
。
海带、马尾藻等藻类的
DNA
提取难度甚至超过了烟
草、龙眼、梨等顽拗植物。尽管近年来，藻类学工
作者已分别在紫菜、龙须菜等红藻，浒苔、石莼等
绿藻以及海带、裙带菜等褐藻中已建立了一系列的
DNA
提取方法，但仍主要集中在鲜活样品的提取
(
王萍等
, 2007;
隋正红等
, 2000;
杨君等
, 2000;
胡
远皆和周志刚
, 2001;
张东等
, 2009)
。
随着分子标记及基因组学研究在海藻遗传学
和育种学研究中不断深入发展，
DNA
的大批量、高
效提取是进行高通量研究的必备手段。同时，由于
大型海藻分布环境特殊性，样品储运条件复杂、运
输时间长也对材料储存工作提出了更高的要求。如
何结合样品储存与研究需要，建立大型海藻样品保
存以及适用的
DNA
提取方法，是海藻分子遗传学研
究面临的主要问题。本文选择了红藻、褐藻、绿藻
门
5
种主要常见的大型海藻为研究对象，分别进行
了活体培养、干燥、冷冻保鲜、低温处理等
10
种不
同的样品储存条件处理，以期摸索出一种经济、有
效的样品保存与
DNA
提取方法，应用于大型海藻分
子遗传学分析等领域。
1
结果与分析
1.1
不同保存方法对
DNA
提取的影响
5
种大型海藻在
10
种保存条件下分别保存
2
个
月，统一采用
CTAB
法提取
DNA
，用琼脂糖凝胶电
泳检测提取情况，部分
DNA
电泳结果
(
图
1)
。不同干
燥方法保存样品提取
DNA
结果显示除高温干燥后
保存的样品外，其它样品均可提取到
DNA
；仅浒苔
活体样品、硅胶干燥样品及龙须菜活体样品观察到
点样孔有残留，可能是糖胶类物质残留造成；亨氏
马尾藻恒温干燥样品及压标本法保存样品观察到
DNA
带拖尾，可能有少量降解；不同干燥方法保存
的海带及亨氏马尾藻样品均观察到
RNA
残留，恒温
保存及压标本法保存的龙须菜样品也观察到有少
量
RNA
残留。不同低温保存样品提取
DNA
结果显示
5
种海藻均能提取到
DNA
；亨氏马尾藻和浒苔
4
℃保
存样品观察到点样孔有残留，龙须菜-
20
℃和-
80
℃
保存样品也观察到点样孔有残留；仅海带-
20
℃和
-
80
℃保存样品有
DNA
带拖尾现象；龙须菜、浒苔
图
1
不同保存方法提取的
DNA
电泳图
注
: 1~3:
海带活体、恒温干燥、低温储存
(
-
80
℃
)
样品
; 4~6:
亨氏马尾藻活体、标本干燥、低温储存
(
-
80
℃
)
样品
; 7~8:
龙
须菜活体样品、恒温干燥样品
; 9~10:
长心卡帕藻活体、低
温储存
(
-
20
℃
)
样品
; 11~14:
浒苔活体、硅胶干燥、低温储存
(
-
20
℃
,
-
80
℃
)
样品
; M: DNAMarker
Figure 1 Electrophoresis figure of genomic DNA extracting
from different methODs preserving sample
Note: 1~3: sample of
L. japonica
; 4~6: sample of
S. henlowianum
;
7~8: sample of
G. Lemaneiformis
; 9~10: sample of
K. alvarezii
;
11~14: sample of
E. prolifera
; M: DNAMarker
和亨氏马尾藻
4
℃保存样品及所有海带冻存样品中
均观察到
RNA
残留
(
表
1;
表
2)
。
1.2
不同保存方法对
DNA
质量的影响
1.2.1
不同干燥方法对
DNA
质量的影响
比较不同干燥方法保存样品所提取的
DNA
的
浓度、纯度及得率结果
(
表
3)
。不同的大型海藻分别
适合于不同的干燥保存条件。海带、龙须菜样品用
恒温干燥法保存提取的
DNA
得率最高
,
其中海带的
浓度为
171.8 ng/μL
，
OD
260
/
OD
280
为
1.70
，得率为
34.36 μg/g
，龙须菜的浓度为
220.5 ng/μL
，
OD
260
/
OD
280
为
1.72
，得率为
44.10 μg/g
；亨氏马尾藻样品
用压标本法干燥保存提取的
DNA
得率最高，浓度为
246.3 ng/μL
，
OD
260
/
OD
280
为
1.67
，得率为
49.26 μg/g
；
长心卡帕藻样品用冷冻干燥法保存提取的
DNA
得
率最高，浓度为
307.7 ng/μL
，
OD
260
/
OD
280
为
1.69
，
得率为
61.54 μg/g
；而浒苔样品用硅胶干燥法保存提
取的
DNA
得率最高，浓度为
245.8 ng/μL
，
OD
260
/
OD
280
为
1.93
，得率为
49.16 μg/g
。
1.2.2
不同冻存方法对
DNA
质量的影响
比较不同冻存方法提取的
DNA
溶液的浓度、纯
度和得率
(
表
4)
。海带样品在-
80
℃冻存提取的
DNA
得率最高，浓度为
250.7 ng/μL
，
OD
260
/
OD
280
为
1.80
，
得率为
50.14 μg/g
；亨氏马尾藻样品
4
℃、-
20
℃、
-
80
℃保存提取的总
DNA
得率、纯度均较高，其中
-
80
℃保存样品提取的总
DNA
得率最高，浓度为