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蒋彩虹等
, 2011,
烤烟净叶黄的赤星病抗性遗传分析及
SSR
标记
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.90 pp.1642-1646 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0090)
1645
上，在培养箱中
28
℃培养两星期。接种前用无菌水
浸泡，轻轻将菌丝体刮下倒在烧杯中，用蒸馏水配
成孢子浓度约为
1
×
10
6
mol/mL
的悬浮液，作为接种
菌液备用。
供试材料长到
9~10
片叶子时，采用划伤悬滴法
接种。每株材料接种两片底部叶片，用接种针在接
种叶片的主脉两侧做
4~6
个十字划伤，在划伤处悬
滴一滴接种菌液，保持相对湿度
80%
、温度
28
℃，
连续培养
3
周后调查发病情况。
3.3 SSR
引物
选用
280
对
SSR
引物，它们均来自
Mueller
等
(2005)
和
Bindler
等
(2007)
发表的烟草
SSR
引物序
列，而且
SSR
标记位于的染色体是已知的，委托上
海生工合成。
3.4 DNA
提取方法及抗感池的建立
本研究采用改良的
CTAB
法提取
DNA
，用琼脂
糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测
DNA
质量，稀
释到浓度为
30~50 ng/
μ
L
，保存在-
20
℃冰箱中备用。
在抗性鉴定的基础上，将
F
2
群体的单株分别提
取基因组总
DNA
。按
Michelmore
等
(1991)
提出的分
离群体分组分析法
(BSA
法
)
，随机选择
10
株抗病株
的
DNA
等量混合建立抗病池，随机选择
10
株感病株
的
DNA
等量混合建立感病池。
3.5
扩增反应程序及电泳显色程序
PCR
体系总体积
25
μ
L
，其中
10
×
Taq
Buffer
2
μ
L
、
MgCl
2
(25 mmoL/
μ
l) 2
μ
L
、
dNTP (2 mmoL/L)
2
μ
L
、
Taq
酶
(5 U/
μ
L) 0.2
μ
L
、
30~50 ng/
μ
L DNA
样品
2
μ
L
、上下游引物
(10 umoL/L)
各
1.5
μ
L
、
ddH
2
O
13.8
μ
L
。试验所用试剂购自
MBI
。
PCR
反应程序：
94
℃变性
6 min
；
94
℃变性
40 s
，
60
℃退火
1 min
，
72
℃延伸
2 min
，
38
个循环；
72
℃
延伸
8 min
，
4
℃保存。退火温度根据引物序列差异
略作调整。
PCR
反应结束后，在反应液中加入
3
μ
L Loading
Buffer
，取
4
μ
L PCR
产物在
8%
非变性聚丙烯酰胺凝
胶上恒电压
1 000 v
电泳约
1 h
。参考任民等
(2008)
NaOH
银染法对电泳后的凝胶进行染色显影。
3.6
数据处理分析
卡方检验采用软件
SPSS 12.0
进行。
遗传距离
(D)
计算方法如下：
(1)
交换值
(r)=(
交
换株数
/
总株数
)
×
100%
；
(2)
按照
Kosambi (1994)
函
数算出遗传距离
(D)
，
D=25
×
ln[(1+2r)/(1
-
2r)]
。
作者贡献
蒋彩虹是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王元
英、罗成刚是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据
分析，论文写作与修改；杨爱国、任民协助完成数据分析，
论文初稿的写作；王静、王绍美参与实验的过程。全体作者
都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家烟草专卖局项目
(110201002002)
资助。
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