Basic HTML Version
史卫东等
, 2011,
菜心小菜蛾抗性基因遗传分析及
SSR
标记
,
分子植物育种
Vol.9 No.89 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0089)
1640
点少、多态信息量低、引物合成和测试耗时耗费大、
不能提供基因信息等。目前利用
SSR
和其它分子标
记构建了很多白菜类的遗传连锁图谱
(
原玉香等
,
2009;
成妍
, 2009)
，国际上也建立了基于
SSR
标记的
白菜图谱
(Kim et al., 2006; Suwabe et al., 2006)
，但
是由于使用的作图群体和标记均不相同，图谱之间
的整合还是一个亟待解决的问题。菜心和拟南芥、
白菜之间亲缘关系接近，与利用结构性分子标记构
建的白菜遗传图谱和拟南芥图谱相比
(Kim et al.,
2006; Suwabe et al., 2006;
成妍
, 2009)
，本研究首次
利用
ESR-SSR
构建的功能性分子标记遗传图谱群
体较小、标记较少、连锁群较少、长度较短和偏分
离比例较大，原因之一是选用的
EST-SSR
引物对数
量仍不够，二是引物设计序列为具有时空表达特性
和无内含子的
cDNA
，多态性远不如基于基因组的
SSR
引物丰富，为此需要将
ESR-SSR
与其它标记相
结合才能构建更精细的图谱。
在育种研究中数量性状依赖于材料本身，应用
上限制较多，不如单显性基因运用方便。利用
EST-SSR
进行分子遗传连锁分析不但能够直接反映
基因的功能信息，而且可以直接克隆差异片段获得
目的基因片段，极大地提高了育种效率和水平，本
研究将
EST-SSR
应用于菜心抗虫性图谱构建，为进
一步开展抗虫基因定位、分离、功能验证等研究提
高了可能性。
3
材料与方法
3.1
供试材料
供试小菜蛾为湖南农业大学提供的敏感种群，
在广西大学昆虫研究所饲养至
3
龄供抗虫试验使用。
菜心抗虫亲本
Caixin65
和感虫亲本
Cxixin69
亲本均
经过田间自然鉴定和离体鉴定，自交多代。
2010
年
秋将两亲本经人工去雄和杂交套袋授粉配制为
F
1
，
同年加代自交抗性
F
1
单株。
2010
年春将
F
2
群体
98
份
及亲本
2
份用于菜心
EST-SSR
分子标记分析。
3.2
菜心抗虫性鉴定
菜心两亲本及
F
1
、
F
2
群体的抗虫性鉴定采用离
体方法，抗性调查及分级标准参考王欣等
(2007)
。
Microsoft excel 2003
软件进行数据统计和卡平方适
合度测验显著性。
3.3
菜心基因组
DNA
的提取及
EST-SSR
反应体系
建立
菜心总
DNA
提取采用
CTAB
法
(Shi et al., 2011)
。
EST-SSR
引物设计，下载
NCBI
十字花科芸薹属
表达序列标签
(Expressed Sequence Tag, EST) 13 747
条，利用
SSR hunter
搜索和查找
SSR
，再根据结果的
同源性和频率高低，选择与抗性与抗逆相关基因
EST
，采用
primer3.0 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)
设计引物。
反应体系
20 μL
：
1
×
PCR buffer 2 μL
、
Taq
DNA
聚合酶
(2.5 U/μL) 1 U
、
dNTP (2.5 mmol/L) 0.4 μL
、
positive primer (10 μm/μL)
、
reverse primer (10 μm/μL)
1 μL
，
DNA (50 ng/μL) 2 μL
，
ddH
2
O 12.6 μL
。反应
条件参考李丽等
(2009)
：
72
℃
3 min
，
94
℃
2 min
；
94
℃
1 min
，
68
℃
1 min
，
72
℃
45 s (
-
1
℃
/2 cycles)
；
20 cycles
；
94
℃
1 min
、
58
℃
1 min
、
72
℃
45 s
，
72
℃
10 min
。聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色。引物、
Taq
聚合酶、
dNTPs
和
DNA Marker
均购自上海英骏
生物技术有限公司。
3.4
遗传连锁分析
按分离群体分组
(bulk segregation analysis, BSA)
分析法
(Michelmore et al., 1991)
，将
F
2
群体单株分别
提取基因组总
DNA
，随机选取
10
个抗虫单株和
10
个
感虫单株，分别等量混合
DNA
建立抗虫池和感虫
池，然后筛选在亲本抗、感池间表现多态性的
EST-SSR
引物对，再利用这些多态性引物分析
F
2
分
离群体多态性。
Mapmake3.0
软件计算扩增位点和目
的基因的遗传距离并构建图谱，
Mapdraw
软件绘制
连锁图谱
(
刘仁虎等
, 2003;
盖红梅等
, 2011)
。
作者贡献
史卫东是本实验设计者和负责人，预备实验，数据分析，
论文写作与修改。梁育喆和周建辉均为实验项目的执行人；
贤振华指导抗虫性鉴定。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本实验获得了广西农业科学院基本科研业务项目
(200805Z)
和广西自然科学基金面上项目
(2010GXNSFA-
013084)
的支助。
参考文献
Chen Y., Geng J.F., Zhang J.Y., Wang Q., Ban Q.Y., and Hou
X.L., 2009, The construction of a genetic linkage map of