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刘硕等
, 2011, SRAP
技术在桃
(
Prunus persica
L.)
遗传多样性研究上的应用
,
分子植物育种
Vol.9 No.76 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0076)
1563
3.2 DNA
提取及
SRAP
分析
3.2.1 DNA
提取
实验材料经液氮浸泡后使用
Geno/Grinder 2000
研磨机磨碎。基因组总
DNA
的提取采用改良
CTAB
法
(Doyle and Doyle, 1990)
，提取后稀释至
20 ng/μL
备用。
3.2.2
引物设计及组合
SRAP
引物参考
Li
和
Quiros (2001)
的引物加以
补充，正向引物
(forward primer) 8
种，反向引物
(reverse primer) 11
种，形成
88
个组合
(
表
5)
。引物由
北京赛百盛生物工程公司合成。
表
5 SRAP
正反向引物序列
Table 5 The forward and reverse SRAP primers in this study
正向引物
Forward primers
反向引物
Reverse primers
Me1:
TGAGTCCAAACCGGATA
Em1:
GACTGCGTACGAATTAAT
Me2:
TGAGTCCAAACCGGAGC
Em2:
GACTGCGTACGAATTTGC
Me3:
TGAGTCCAAACCGGAAT
Em3:
GACTGCGTACGAATTGAC
Me4:
TGAGTCCAAACCGGACC
Em4:
GACTGCGTACGAATTTGA
Me5:
TGAGTCCAAACCGGAAG
Em5:
GACTGCGTACGAATTAAC
Me6:
TGAGTCCAAACCGGTAA
Em6:
GACTGCGTACGAATTGCA
Me7:
TGAGTCCAAACCGGTCC
Em7:
GACTGCGTACGAATTCAA
Me8:
TGAGTCCAAACCGGTGC
Em8:
GACTGCGTACGAATTCTG
Em9:
GACTGCGTACGAATTCGA
Em10:
GACTGCGTACGAATTCAG
Em11:
GACTGCGTACGAATTCCA
3.2.3 SRAP-PCR
反应体系及程序设定
扩增反应在
Bio-RAD C1000
型
PCR
仪上进行，
反应程序在
Li
和
Quiros (2001)
基础上优化为
95
℃
预变性
5 min
；
94 60 s
℃
，
34 6
℃
0 s
，
72 60 s
℃
，循
环
5
次；
95 60 s
℃
，
50 60 s
℃
，
72 60 s
℃
，循环
35
次；
72
℃
延伸
10 min
。
PCR
反应总体积为
20 μL
，
包括
100 ng DNA
模板、
1.5 mmol MgCl
2
、
0.2 mmol
dNTPs
、
0.2 umol
引物、
1.0 U
Taq
DNA
聚合酶和
1X
Buffer
。以上试剂全部来自北京天根生化科技有限
公司。
3.2.4 PCR
产物检测
PCR
扩增产物经
95
℃
变性处理
10 min
，冰上冷
却后用
4.5%
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒功率
75W
电泳
50 min (Bio-rad 38×30 cm
电泳系统
)
，电泳
后利用银染法进行条带的展示
(
韩永亮和常金华
,
2006)
。电泳胶板晾干后进行条带的统计，并拍照记
录图像。
3.2.5
数据分析计算
SRAP
图谱仅统计条带清晰、片段大小为
80~600 bp
的条带，有带记为
1
，无带记为
0
，形成数
字化矩阵数据。用
NT-sys2.10e
软件，采用
Jacard
相
似系数计算群体间遗传距离
(genetic distance, GD)
，
利用非加权分组平均法
(unweighted pair group
method with arithmetic mean, UPGMA)
进行聚类分
析。相似系数计算公式为
S
ij
=a/(a+b+c)
，其中
a
为两
份样品共有带数，
b
为
i
样品的特有条带数，
c
为
j
样
品的特有条带数，遗传距离
GD=1-S
ij
。利用
SPSS12.0
软件分析
SRAP
标记与桃重要性状之间的相关性。
计算各个引物组合的多态性比例
(
多态性比例
%=
多
态性条带数
/
扩增总条带数
×100%)
和多态信息含量
(polymorphism information content, PIC) (Botstein et
al., 1980)
。
作者贡献
刘硕、刘冬成、刘威生、章秋平和刘有春是本研究的
实验设计和实验研究的执行人；刘硕、刘冬成和章秋平完成
数据分析，论文初稿的写作；赵剑波、李绍华和张爱民参与
实验设计，试验结果分析及论文修改；李宝江是项目的构思
者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。
全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由公益性行业
(
农业
)
科研专项
(3-37)
资助。本文
中提到了我们实验中涉及的有关试剂供应商和测序服务商，
这并非我们为这些试剂供应商和测序服务商的产品和服务
提供推荐或背书。