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孙翊等
, 2011,
瓜叶菊
F3H
同源基因表达与花青素苷合成的相关性分析
,
分子植物育种
Vol.9 No.68 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0068)
1502
为
1 cm)
。
3.3 Southern blot
分析
用
CTAB
法提取瓜叶菊基因组
DNA
，用分光光
度计
(SmartSpec Plus Spectrophotometer, Bio-Rad
Laboratories, Inc.)
测量
DNA
纯度及浓度，分别用
Eco
R
Ⅰ和
Bam
H
Ⅰ酶切基因组
DNA(30 µg)
，将酶切
产物在
0.8%
琼脂糖上进行电泳。转印至硝酸纤维素
膜
(Hybond N
+
membrane, Amersham)
。根据已知序
列编码区的保守区设计探针，长度约
500 bp
，上游
引物为
F3H1
：
3'
-
GGNGGNAARAARGGNGGNTT
YAT
-
5'
，下游引物为
F3H2
：
3'
-
CANCANGCYTGRT
GRTCNGCRTT
-
5'
，
PCR
扩增采用的模板为克隆至
pGM-T Easy
载体中的瓜叶菊
F3H
同源基因片段，并
用
DIG (digoxigenin, Roche)
进行标记。杂交及信号
检测操作均按照
DIG
杂交试剂盒
(DIG hybridization
Kit, Roche)
说明书进行。
3.4 Northern blot
分析
采用改良
CTAB
法提取瓜叶菊中不同材料的总
RNA (
孟丽等
, 2006)
，用
DNase (Promega Corporation)
消化基因组
DNA
，用分光光度计
(SmartSpec Plus
Spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, Inc.)
测量
RNA
的浓度，并且用
rRNA
条带的
EB
染色亮度进行
定量，确定每个泳道的上样量一致。每个泳道中总
RNA
的上样量为
20 µg
，采用
Sambrook
和
Russell
(2001)
的方法进行
RNA
电泳及转印至硝酸纤维素膜
(Hybond N
+
membrane, Amersham)
操作
(Sambrook
and Russell, 2001)
。探针制备同
3.3
。杂交及信号检
测操作均按照杂交试剂盒
(DIG hybridization Kit,
Roche)
说明书进行。
作者贡献
孙翊是本研究的实验设计和实验研究的执行人；孙翊完
成数据分析，论文初稿的写作；孟丽和胡可参与实验设计，
试验结果分析以及论文修改；戴思兰是项目的构思者及负责
人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者
都已经阅读本文并同意最终的文本。
致谢
本项研究工作得到国家自然科学基金
(No.30671714
和
No.31071823)
，国家林业局林业公益性行业科研专项
(No.
200904050)
、中国科学院方向性项目
(No.KSCX2
-
YW-N
-
043)
以及高等学校博士学科点专项科研基金
(20070022009)
项目
共同资助。
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