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黄文静等
, 2011, SRAP
和
RGA
标记技术在甘薯的抗茎线虫病遗传多样性中的应用
,
分子植物育种
Vol.9 No.46 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0046)
1348
提取的
DNA
经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计
检测，电泳条带清楚且所提取的基因组
OD
260
/
OD
280
在
1.8~2.0
之间的
DNA
，置-
20
℃冰箱保存并用于
PCR
分析。
3.3
引物设计
利用
Blast
软件，对
Genebank
数据库中由王钰
等克隆的
342
个甘薯
RGA (
编号为
DQ903322-DQ90-
3664)(
王钰等，
2008)
与抗线虫病基因
(
RGC1
、
RX
)
进行比对，筛选出与抗病基因同源性高于
50%
的
RGA
序列，以高抗甘薯茎线虫病品种徐
78-1
和感茎
线虫病品种徐薯
18
的基因组
DNA
为模板进行
PCR
扩增，进行第一轮筛选。没有多态性的
RGA
与
SRAP
组合成
SRAP-RGA
引物。再以抗茎线虫病品种为模
板进行第二轮筛选。从
40
对
SRAP-RGA
引物组合中
筛选出五对有多态性的引物
(
表
3)
为抗茎线虫病聚
类引物。
SRAP
引物序列参考
Li and Quiros(2001)(Li
and Quiros
，
2001)
。
表
3
扩增甘薯基因组的引物对
Table 3 Lists of primer pairs used to amplify genomic DNA of sweet potato
上游引物
Forward primers
下游引物
Reverse primers
名称
Name
序列
(5’
-
3’)
Sequence(5’
-
3’)
名称
Name
序列
(5’
-
3’)
Sequence(5’
-
3’)
EM3
GACTGCGTACGAATTGAC
S2-A05-F
CCTTTCCGCAATCCAATG
EM4
GACTGCGTACGAATTTGA
S2-A07-F
TCGGCCACATGTTTTAGG
EM3
GACTGCGTACGAATTGAC
S2-A08-F
GATTACCACCTGAACCAGCA
EM8
GACTGCGTACGAATTAGC
S1-F03-F
GGAGGCCGTTACATTTCTCA
EM3
GACTGCGTACGAATTGAC
S2-D12-F
CGCTGCAACCAAGAACAA
3.4 PCR
扩增和检测
根据优化实验的结果，
PCR
反应体系为
20 μL
，
包括：模板
DNA 100 ng
，
2.5×PCR Buffer 2 μL
，
0.5
mmol/L dNTPs
，
0.375 μmol/L
引物，
Taq
DNA
聚合
酶
1 U (
上海生工生物
)
，用
ddH
2
O
调整体系，使反应
终体积为
20 μL
。
PCR
反应程序如下：
94
℃预变性
5
min
；反应前
5
个循环为
94
℃变性
45s
，
45
℃复性
45s
，
72
℃延伸
l min
；随后的
35
个循环退火温度提高到
50
℃，
72
℃延伸
7 min (Wang et al., 2009)
。
PCR
扩增产物
94
℃变性
3 min
后，
6%
变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳，
95V
电泳
1.5 h
，银染检测。
3.5
数据分析
对不同引物在各甘薯材料中的
SRAP-RGA
扩
增情况做记录，统计清晰的条带，有带的记为
1
，
无带的记为
0
，得到二元数据资料，形成
0
，
1
矩阵。
50
个品种间的遗传相似性根据
Nei
和
Li
描述的方
法
(Nei and Li, 1979)
由
Dice
相似性系数计算获得。
遗 传 距 离 由 公 式
GD=1-GS
计 算 得 到 。 根 据
NTSYS-Pcversion2.1
软件应用
UPGMA(Xiao et al., 2008)
法进行聚类分析，并采用软件处理，建立聚类图。
作者贡献
黄文静、陈达伟、季必霞是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；黄文静完成数据分析，论文初稿的写作；蒋琳
参与实验设计，试验结果分析；王钰是本项目的构思者及负
责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作
者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由安徽省自然科学基金
(11040606M84)
资助。作
者感谢安徽大学提供了优越的实验条件以及仪器设备。本文
中提到了我们实验中涉及的有关试剂供应商，这并非我们为
这些试剂供应商的产品和服务提供推荐。
参考文献
Austin D.F., 1988, The taxonomy, evolution and genetic
diversity of sweetpotato and related wild species
exploration, maintenance and utilization of sweet potato
genetic resources, International Potato Center, Lima, Peru.,
27-61