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闫小燕等, 2011, 冷诱导基因 wcs19 与小麦抗寒性关系研究, 分子植物育种 Vol.9 No.45 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0045)
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3.2 试验方法
3.2.1 小麦抗寒性鉴定
采用麦芽冰冻恢复力鉴定法，具体方法为：随
机挑选 50 粒小麦种子，放在铺有湿润滤纸的培养
皿内，室内发芽。当麦芽长到 1 cm~2 cm 时，将其
移到 4℃ 冰箱锻炼 10 d，然后放置到-20℃ 冰冻 12 h ，
取出后移到 4℃ 冰箱解冻一天，最后在室温下恢复
生长 3 d，记录麦芽总数和存活麦芽数，计算麦芽
冰冻恢复率 (董玉琛等, 2000)。
麦芽冰冻恢复率=存活麦芽数/麦芽总数×100%
根据麦芽冰冻恢复率，比较小麦样品间的抗寒性。
3.2.2 引物的设计与合成
基于 GenBank 登录号为 L13437 的 mRNA 序
列，运用 Primer premier 5.0 软件进行引物设计，并
用 Oliger 软件对引物进行分析，共设计分析了 4 对
引物，详见表 2。
表 2 wcs19 基因的特异引物序列
Table 2 Specific primers sequence of wcs19 genes
引物编号
Primer name
引物序列
Primer sequence
引物位置
Primer location
Tm 目标长度
Target length
Wcs19a F: 5′- GACCAATGGCTTCTTCTTCC- 3′
R: 5′- GGCGACTTTGTCCGTGAT-3′
44 465 59.7℃ 422 bp
Wcs19b F: 5′- CTACCCTACCCACCCATCC-3′
R: 5′- ACATTAACAGTGCGGTAATCCT-3′
7 631 57.7℃ 625 bp
Wcs19c F: 5′- GACCAATGGCTTCTTCTTCC- 3′
R: 5′- TGAGCGATACAGATCGGACTA-3′
44 530 58.9℃ 487 bp
Wcs19d F: 5′- CACAACCTACCCTACCCACC- 3′
R: 5′- CTCCTCCGTCGCCTTCTT- 3′
1 414 59.2℃ 414 bp
以上引物均由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成。
3.2.3 基因组总 DNA 的提取
采用 SDS—Tris 饱和酚法提取小麦基因组总
DNA(Gale et a1., 2001)，用 1.5%琼脂糖电泳检测
DNA 质量。
3.2.4 PCR 检测
PCR 扩增于 BIO-RAD My Cycler 1.0 上进行。
反应体系为：总体积 10 μL，其中含有 0.25 mmol/L
dNTP，1×PCR Buffer，2.5 mmol/L Mg2+ ，上下游引
物各 0.25μmol/L，0.5 U DNA Taq 聚合酶，40 ng 模
板 DNA。
PCR 反应条件为：94℃预变性 5 min；94℃ 变
性 1 min，50℃ ~60℃ 退火 1 min；72℃ 延伸 l min，
共 38 个循环；最后 72℃ 延伸 8 min，4℃保存。PCR
扩增产物用 2.0%琼脂糖凝胶，以 120V 恒压电泳分
离，EB 染色，凝胶成像系统照相保存。
3.2.5 序列测序与分析
测序由上海英骏公司(www.invitrogen.com) 完
成，应用 DNAMAN6.0 软件对测序获得的序列进行
比对分析。
作者贡献
闫小燕、周志良、徐恩静是本研究的实验设计和实验
研究的执行人；司红起、闫小燕完成数据分析，论文初稿的
写作；周志良、徐恩静参与实验设计，试验结果分析；王永
玖为本实验提供实验材料；马传喜、司红起是项目的构思者
及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全
体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由现代农业产业技术体系专项经费和国家科技
支撑计划(2009BADA6B01)共同资助，本文中提到了我们实
验中涉及的有关试剂供应商和测序服务商，这并非我们为这
些试剂供应商和测序服务商的产品和服务提供推荐或背书。
参考文献
Chauvin L.P., Houde M., and Sarhan F., 1993, A leaf-specific
gene stimulated by light during wheat acclimation to low
temperature, Plant Molecular Biology, 23: 255-265
Dong Y.C., and Zheng D.S., 2000, Chinese wheat Genetic
resources,Agricultural Press, Beijing, China, pp.240-242