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肖炳光等
, 2011, 23
份烟草品种遗传关系的
SSR
分析
,
分子植物育种
Vol.9 No.39 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0039)
1300
位基因，平均每对引物可检测
2.29
个等位基因。而
Moon
等
(2009)
利用
70
个
SSR
引物在
117
份美国烤
烟材料中共检测到了
1031
个等位基因，平均每个
标记可检测到的等位基因数是
14.7
个，约是我们的
6.14
倍，这可能是因为
Moon
等
(2009)
采用了具有
高灵敏度的荧光毛细电泳检测技术，而我们则是采
用分辨率较低的
6%
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测技术。
2.2
烟草品种间遗传多样性与亲缘关系
SSR
分子标记聚类结果
(
图
3)
表明，烟草栽培
品种间亲缘关系的远近与人为划分的烟草类型有
一定的相关性。如在遗传相似系数
GS=0.720
处
(L1)
，香料烟品种
Turkey Basma(Nt4)
和
Samsun(Nt5)
聚为一类，晒烟品种
Florida301(Nt1)
和
TI245(Nt21)
各自聚为一类、且与其它烟草类型分开；在遗传相
似系数
GS=0.875
处
(L1)
，白肋烟品种
Burley21(Nt2)
和
TN86(Nt3)
聚为同一亚类。这一结论与此前利用
ISSR
分析的结果比较吻合
(
肖炳光等
, 2007)
。
我国选育的烤烟品种与从美国引进的烤烟品
种之间的遗传差异并未因地理来源的不同而呈明
显的区别，它们聚为同一亚类、遗传关系较近，主
要是由于我国烤烟品种大多以美引品种为直接或
间接亲本选育而成，如云烟
85(Nt9)
、云烟
87(Nt10)
和云烟
97(Nt11)
的亲源中都有
K326(Nt8)
。
Arslan
等
(2006)
利用
RAPD
标记对
22
个来自土耳其和美国
的烤烟品种的遗传多样性分析结果也表明，具有相
同加工品质特性而地理来源不同的烤烟品种归为
一类，与本研究的结论类似。究其原因，可能是当
前的栽培品种为了迎合消费者的需求进行了严格
的定向选择，而使许多非育种目标的多样化性状丢
失，导致了遗传多样性降低。
我国烤烟主栽品种遗传基础极其狭窄，应充分
利用净叶黄
(Nt22)
等地方品种作为亲本来拓宽育成
品种的遗传基础。参试的津巴布韦烤烟主栽品种或
后 备 品 种 间 遗 传 相 似 度 也 非 常 高 ， 其 中
KRK26(Nt15)
的亲本之一是津巴布韦国内自主创制
的种质
MsRW(Nt14)
，推测其它几个品种的亲本之
一也可能含
MsRW(Nt14)
或与
MsRW(Nt14)
亲缘较
近。因我国烤烟主栽品种与津巴布韦烤烟主栽品种
或后备品种聚为不同的亚类，遗传关系相对较远，
从田间表现看差异也较明显，因此可适当引进种植
一定面积的津巴布韦烤烟品种，以在一定程度上缓
解我国烤烟生产上种植品种单一化的矛盾。
3
材料与方法
3.1
供试材料
参试烟草品种共
23
份
(
表
3)
，其中烤烟
17
份
(
含
津巴布韦引进品种
8
份
)
、晒烟
2
份、白肋烟
2
份和
香料烟
2
份，均由云南省烟草农业科学研究院、中
国烟草育种研究
(
南方
)
中心提供。
Taq
Polymerase
、
dNTPs
、
100 bp DNA ladder
marker
购自宝生物
(
大连
)
有限公司；丙烯酰胺和甲
叉双丙烯酰胺购自
USB Corporation(
美国
)
；
Tis-Base
、
Boric Acid
、
EDTA-2Na
和
CTAB
购自
Amersham Biosciences(
美国
)
；其余试剂为国产。
3.2 SSR
引物
所用的
700
对
SSR
引物分两部分：一部分是
Bindler
等
(2007)
发表的，共有
119
对；另一部分是
基于
TGI
发布的烟草基因组序列和公共数据库
TIGR(http://www.tigr.org/tdb/)
提供的烟草表达序列
(EST)
，由云南省烟草农业科学研究院
[
中国烟草育
种研究
(
南方
)
中心
]
与浙江大学农业与生物技术学
院联合开发的
(
尚未公布
)
，共有
581
对。所有引物
由宝生物
(
大连
)
有限公司合成。
3.3 SSR
扩增
基因组
DNA
的提取及检测在
De Riek
等
(2001)
的方法上略作修改。
PCR
扩增体系为
20 μL
，其中
15~30 ng/μL DNA
1.5 μL
、
10×PCR reaction Buffer (Mg
2+
plus) 2 μL
、
25
mmol/L dNTPs 1.5 μL
、
10 μmol/L
正反向引物各
1.5
μL
、
r
Taq
0.75 U
。
PCR
扩增在
Bio-RAD Master Cycler
C1000
上进行，先在
94
℃
下预变性
5min
；再进行
30
个循环的变性
(94 , 30s)
℃
、退火
(
退火温度随引物
的不同而改变，
30s)
、延伸
(72 , 30s)
℃
步骤；然后在
72
℃
下继续延伸
5~7min
；最后在
4
℃
下保存。
扩增产物加
1/6
体积的
6×Loading Buffer
，取
2.5 μL
利用
6%
的非变性聚丙烯酰胺凝胶在
DYY-12
型电泳仪
(
北京六一厂
)
上电泳分离，然后参照
Bassam
等
(1991)
的方法进行银染检测。
3.4
数据分析
扩增产物按同一迁移位置上条带在各个材料
中的有
(
记为
1)
、无
(
记为
0)
和缺失
(
记为
2)
进行统
计。参试的每两份材料间的遗传相似系数
(genetic
similarity coefficient, GS)
用
Nei-Li(1979)
的公式计
算。利用
NTSYSpc Version 2.11
软件
(Rohlf
等
,
1998)
按照类平均法
(UPGMA)
进行聚类分析，构建
聚类图。
作者贡献
肖炳光、高玉龙是本研究的实验设计和实验研究的执
行人；肖炳光完成数据分析，论文初稿的写作；吴为人参与
实验设计，试验结果分析，论文修改；肖炳光是项目的构思
者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。