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张如华等
, 2011,
柽柳
EST-SSRs
标记开发与群体检测
,
分子植物育种
Vol.9 No.38 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0038)
1296
不少于
3
次等，检索含有精确
SSR
基序
(motif)
。
3.2.3 EST-SSR
引物设计
采用
PRIMER5.0
软件对串联重复长度大于
18 bp
的重复序列进行
SSR
引物设计。引物设计的要求为：
扩增产物长度
100 bp~500 bp
；引物长度
18 bp~24 bp
，
各距重复序列不少于
20 bp
，
GC
含量
40%~60%
，退
火温度
Tm
值
50
℃
~62
℃，且上下游引物的
Tm
值相差
不大于
5
℃；尽量避免引二聚体、发夹结构、错配等。
3.2.4 PCR
扩增及产物检测
以柽柳总
DNA
为模板，
PCR
反应体系为
10 μL
，
其中含
10
×
PCR
缓冲液
1 uL
，
Mg
2
＋
1.25 mmol/L
，
dNTPs 1.25 mmol/L
，上下游引物各
0.5 umol/L
，
Taq
聚合酶
1.25 U (5 U/uL)
，
DNA 20 ng
左右。
PCR
反应
程序的变性温度为
94
℃
(
预变性
5 min,
变性
30s)
，
退火
(30s)
温度采用
Touch-down
方式
(
从
60
℃到
49.9
℃
,
每循环降
0.7
℃
)
，
72
℃延伸
(30s)
，
14
个循环；
再进入退火温度为
50
℃的
15
循环
(
延伸为
1 min)
。采
用
8%
聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，产物经银染后
对各位点进行判读。
3.2.5
数据处理
按共显性标记处理数据，依次按照电泳条带的
DNA
长度从小到大顺序以
A
、
B
、
C
、
D
、
E
…编号统
计结果。运用
POPGEN32
软件
(Yeh et al., 1997)
进行
群体分析，主要参数有等位基因数目
(A)
、实际杂合
度
(H
0
)
、期望杂合度
(He)
、基因多样度
(h)
及
Nei
无偏
遗传距离
(Nei and Li, 1979)
，并利用
NTSYS2.1
软件
(Rohlf, 2002)
对遗传距离采用
UPGMA
法构建聚类图。
作者贡献
张如华
李锐
赵景奎是本研究的执行人，包括实验操
作、数据分析及论文初稿的写作等；徐立安为项目的构思者
及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全
体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由江苏省高技术研究项目
(BG2005319)
资助。感
谢南京林业大学温强、白天道、王仲伟博士生，曹牧硕士等
在群体样本采集、实验及数据分析中提供的大力帮助。
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