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孙传波等
, 2011,
农杆菌介法将耐盐基因
HAL1
转入玉米自交系
H99
的研究
,
分子植物育种
Vol.9 No.22 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0022)
1165
共培养培养基：
1/2 MS
大量，
1/2 MS
微量，
1/2 MS
维生素，
2,4
-
D 1.5 mg/LAS100 mg/LAgNO
3
850 mg/L
+
半光氨酸
100 mg/L+3%
蔗糖
pH=6.0
；恢复培养基：
1/2 MS
大量，
1/2 MS
微量，
1/2 MS
维生素，
2,4
-
D
1.5 mg/L +MES 0.5 g+AS100 mg/L+Cef 500 mg/L+3%
蔗糖
pH=6.0
；筛选培养基：
1/2 MSZ+2,4
-
D 1.5 mg/L
+MES 0.5 g +Cef 500 mg/L+
除草剂
(Bar 3.0 mg/L)
+3%
蔗糖
pH=6.0
；分化培养基：继代培养基
+KT
0.5 mg/L+Cef 500 mg/L
代培养基
+KT 0.5 mg/L+Cef
500 mg/L pH=5.8
；生根培养基：继代培养基
+IBA
0.5 mg/L +Cef 500 mg/L+
活性炭
5 g/L pH=6.0
。
3.2
方法
3.2.1
外植体的获取
取授粉
9~13d
，
1 mm
左右的幼胚接种在诱导培
养基上，每
14 d
继代一次，继代
3
次后得到胚性愈
伤组织。
3.2.2
农杆菌转化
3.2.2.1
工程菌的制备
将含有质粒
pC3301-
HAL1
的农杆菌
EHA105
在
含相应抗生素的
YEP
液体培养基中
28
℃，
180 rpm
培养至
OD
600
值在
0.8
左右，离心
5 min
收集菌体，
然后用侵染培养基重悬菌体，加入乙酰丁香酮
(AS)
100 μmol/L
，调整重悬液浓度至
OD
600
=0.6
。
3.2.2.2
外植体的侵染
将继代
0~12 d
的愈伤组织分别集中于小三角瓶
中，用
OD
值为
0.2
、
0.4
、
0.6
、
0.8
、
1.0
的重悬菌液
在不同真空压力条件下侵染
5 min
、
10 min
、
15 min
、
20 min
、
30 min
，侵染结束后将愈伤组织置于带滤纸
的培养皿中，吸去多余菌液后放在共培养基上，
21
℃
共培养
3 d
。
3.2.3
转化植株的获得
3.2.3.1
抗性愈伤组织的的筛选
共培养
3 d
后的愈伤组织转移至恢复培养基
中，恢复培养
4 d
后转移至筛选培养基中筛选抗性
愈伤组织。每
14 d
筛选一次，
3
次筛选后得到抗性
愈伤组织。
3.2.3.2
抗性愈伤组织的分化
筛选得到的抗性愈伤组织置于分化培养基中，
在
27
℃，
2000Lx
光强，每天光照
16 h
的条件下分
化生长，直至得到幼苗。
3.2.3.3
壮苗培养和移栽
将幼苗放在生根培养基中生长，待根系发达
后，敞开瓶口炼苗，
1
周后移栽于温室。
3.2.4
转化植株的
PCR
检测
3.2.4
.
1 DNA
的提取
当转化植株处于
4
叶期时取玉米幼嫩的叶片，
用
CTAB
法提取转基因玉米的基因组
DNA
。
3.2.4.2 PCR
检测抗性植株
根据
HAL1
的基因序列设计引物
PCR
引物：
PR
：
5'CCAGAAACCCACGTCATGCC3' PF
：
5'CAG
GAACCGCAGGAGTGGA3'
；反应体系为
20 μl
。
PCR
扩增序为：
(1)95
℃，预变性
5 min
；
(2)95
℃，变
性
1 min
；
(3)56
℃，退火
30 s
；
(4)72
℃，延伸
30 s
；
(5)
重复步骤
(2)~(4)40
次；
(6)72
℃延伸
10 min
。
PCR
产物
大约
375 bp
。
作者贡献
孙传波是本研究的实验设计和论文初稿的写作，孙传
波、郭嘉、陶蕊、孟凡梅和曲文利参与实验研究的执行和数
据分析；韦正乙提供植物表达载体，李海华负责转化植株在
责温室的生长，刘文国和袁英是项目的构思者及负责人，指
导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读
并同意最终的文本
。
致谢
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项课题
(2009ZX08003-018B)
资助。
参考文献
Bordas M., Montesinos C., Dabauza M., Salvador A., Roig LA.,
Serrano R., and Moreno V., 1997, Transfer of the yeast salt
tolerance gene
HAL1
to
Cucumis melo
L. cultivars and in
vitro evaluation of salt tolerance, Transgenic Res., 6:
41-50
Gould J., Devey M., Hasegawa O., Ulian E.C., Peterson G., and
Smith R.H., 1991, Transformation of
Zea mays
L. using
Agrobacterium tuniefaciens
and the shoot apex, Plant
Physiol., 95: 426-434
Huang L., and Wei Z.M., 1999,
Agrobacterium tumefaciens
mediated maize transformation, Shiyan Shengwu Xuebao