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王月志等
, 2011,
砂梨
MYB
基因启动子克隆、生物信息学预测与等位变异分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.110 pp.1799-1806
(doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0110)
1804
子未被鉴定。对所克隆
4
个砂梨
MYB
基因启动子
序列的预测分析发现，尽管各启动子序列调控元件
存在分化，但组成相似
(
表
2)
，因此可以推测：这
4
个
MYB
基因可能在砂梨的生长发育过程中具有某
些相似的生物学功能，
PpMYBx2
并非是唯一调控砂
梨木质素合成的基因。此外，木质素生物合成涉及
多个环节以及不同的催化酶类
(
陈永忠等
, 2003;
Boerjan et al., 2003)
，因此不排除存在
MYB
以外调
控因子变异引起的木质素相关性状遗传差异。
本研究克隆获得了
4
个砂梨
EgMYB2
同源基因
的启动子序列，是在园艺植物中克隆到的关于木质
素合成代谢关键基因的调控序列。该项研究对于探
明砂梨与木质素相关品质性状形成的分子机制和
利用基因调控技术进行砂梨品质育种具有重要意
义。另外，利用生物信息学对砂梨
MYB
基因启动
子调控元件进行了预测和分析，并进行了启动子序
列的等位变异分析，为开展该基因的表达研究和遗
传定位，进一步确定其功能奠定了基础。
3
材料与方法
3.1
材料
于
2010
年
4
月在浙江省农业科学院果园
(
杭州
)
取绿果皮砂梨材料
19-59
、
19-67
、
21-65
、
20-62
、
20-71
、
19-52
、
5-18
、
‘
初夏绿
’
、
5-18
、
31-3
，褐色
果皮砂梨材料
‘
秋荣
’
、
19-39
、
19-40
、
‘
清香
’
、
19-38
、
19-42
、
19-43
、
19-47
、
19-49
、
20-72
的幼叶，液氮
冷冻后-
70
℃
保存备用。
3.2
基因组
DNA
提取
利用改良的
CTAB
法
(
刘小勇等
, 1997)
提取各
砂梨材料的基因组
DNA
，用
0.8%
琼脂糖凝胶电泳
检测所提
DNA
的纯度和完整性，用
U-0080D
(Hitachi)
紫外分光光度计检测
DNA
浓度，将检测后
的各
DNA
样品存于-
20
℃
冰箱备用。
3.3
同源基因搜索与序列分析
利用桉树
EgMYB2
基因的蛋白序列
(CAE09057)
通过
BlastP
搜索苹果蛋白数据库
(http://www.rosace-
ae.org/projects/apple_genome)
，获取苹果对应同源基
因的基因组序列，再利用
softberry
数据库
(http://www.
softberry.com)
对苹果各同源基因的启动子区进行在
线预测，砂梨基因启动子序列的预测方法相同。
3.4
目标序列的
PCR
扩增
根据启动子预测结果，在各基因起始密码子上
游保守区设计可以扩增完整启动子的引物。引物序
列由上海桑尼生物科技有限公司合成。反应体系
为：
PCR
反应体系
25 μL
，反应混和物中包括
30 ng
模板，正、反向引物各
5 pmoL
，
dNTP
各
5 nmoL
，
MgCl
2
37.3 nmoL
，
r
Taq
DNA
聚合酶
0.5 U (Takara,
Japan)
，
10×
酶自带的
PCR
缓冲液
(2.5 μL)
。
PCR
反应程序为：
94 3 min
℃
；
94 30 s
℃
；
58 30 s
℃
；
72
℃
1 min 30 s
，
35
个循环；
72 7 min
℃
。应用
ThermoHybaid
梯度
PCR
仪进行扩增。用
1%
琼脂糖
凝胶对
PCR
产物进行电泳分离。
EtBr
染色，凝胶
成像系统照相。
3.5
目的片段的回收、克隆、测序
用
UNIQ-10
柱式
DNA
胶回收试剂盒
(
上海生
工生物工程技术服务有限公司
)
回收目的片段
,
方
法 参 照 产 品 说 明 。 将 纯 化 的 目 的 条 带 用
pGem-T-Easy
载体
(
购自
Invitrogen
公司
)
克隆，方法
参照厂商说明书。用各基因启动子特异引物通过
PCR
方法筛选阳性克隆。质粒提取及测序由上海桑
尼生物科技有限公司完成。
3.6
序列同源性分析、启动子预测及调控元件的注
释分类
序列排列和同源分析采用
ClustalW
方法
(Thompson et al., 1994)
，参数采用
MegAlign
(Clewley and Arnold, 1997)
软件的默认值。序列启动
子及调控元件预测采用
softberry
网站的植物启动子
及调控元件在线预测服务
(http://www.softberry.com/
berry.html)
。根据预测结果，对调控元件进行功能
注释，再按调控元件的类型将其分为组织特异类、
生物胁迫应答类、非生物胁迫应答类、胁迫激素应
答类、生长类激素应答类及其它共
6
种类型。
3.7
检测启动子区等位变异引物的开发及其在褐皮
与绿皮砂梨中的扩增
按照材料与方法
3.4
与
3.5
分别克隆
3
个褐皮
和
3
个绿皮砂梨材料中
EgMYB2
同源基因的启动子
序列，测序后再分析各启动子序列在绿皮材料和褐
皮材料间的等位变异，根据分析的结果设计可以检
测等位变异的
PCR
引物，并以不同等位变异序列的
克隆为模板，检测所设计引物对启动子等位变异的
分辨效果。用检测有效的引物扩增更多的褐皮和绿
皮砂梨材料，以分析所获得的等位变异与砂梨褐皮
/
绿皮性状间的相关性。