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王俊峰等
, 2011,
山东省
12
份水稻种质的
DNA
指纹数据库构建
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.107 pp.1776-1783 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0107)
1782
定、种子质量和保护专利权上发挥着重要作用，它
也被应用到品种的亲缘关系划分、农作物育种和农
作物遗传作图等方面
(
王忠华
, 2006;
陈杰等
, 2007,
农业考古
, 3: 69-71)
。但是，由于我国在水稻
DNA
指纹图谱的研究上才刚刚起步，国内各个研究机构
研究水平不一，
DNA
指纹数据库构建所采用的技
术、标准和软件等各不相同，存在着若干个不同的
DNA
指纹数据库，且大多数数据库间存在不能兼容
的现状
(
陈英华等
, 2009;
程本义等
, 2009;
马琳等
,
2010;
马红勃等
, 2010;
马红勃等
, 2009,
三明农业
科技
, 3: 1-4)
。这种情况的存在限制了各个数据库之
间的数据交换并导致资源的浪费，更为重要的是它
使水稻
DNA
指纹数据库间没有了统一标准，造成
了单个数据库容量不足、覆盖率不足、分辨率不足
和不稳定等缺点，阻碍了水稻
DNA
指纹数据库的
构建和发展，影响了对水稻分子育种工作的深入研
究，对该问题的研究及解决应该引起我们的重视。
我国具有丰富且独特的水稻种质及其基因资源，加
速构建水稻
DNA
指纹数据库的基本平台，统一技
术标准，对实现我国水稻
DNA
指纹数据库的标准
化、自动化和数字化有着重要意义。
3
实验材料与方法
3.1
实验材料
本研究的实验材料由山东省农业科学院高新
技术中心的姚方印研究员提供。选取山东省特有、
优异水稻资源
12
份品种名称及编号见表
1
。
3.2
水稻的萌发
在
15 cm
×
15 cm
的方形培养皿中，放入
4
张
大小合适的方形滤纸，加入蒸馏水润湿后，摆放水
稻种子。将放有种子的培养皿置于
27
℃的培养箱
中，暗培养
7 d
。
3.3 DNA
的提取
取出于
27
℃暗培养
7 d
后的水稻幼苗，放入研
钵中并加入液氮，研成粉末后，通过
CTAB
法提取
其
DNA (Doyle and Doyle, 1990)
。加入
RNaseA (
北
京天根
)
，去除样品中的
RNA
。加入酚氯仿，变形
样品中剩余的蛋白，并通过冷冻的异丙醇沉定
DNA
。
3.4 PCR
在
10 μL
的
Taq
Plus PCR MasterMix (
北京天根
)
中体系中加入
0.1 μg DNA
和
1 μL
引物
(
中国水稻研
究所国家水稻数据中心
,
表
4)
，通过以下条件进行
PCR
：
94
℃预热
3 min
，
94
℃
30 s
，
51
℃
30 s
，
72
℃
30 s
，
35
个循环结束后
72
℃延伸
5 min
。
3.5 SSR
电泳
电泳采用
6%
的非变性丙烯酰胺凝胶电泳，设
备为
BIO-RAD
的核酸序列分析电泳
Sequi-Gen GT
。
每个泳道上样
2 μL
，恒定功率
65 W
，电泳
80 min
后，通过碳酸钠银染的方法显示条带
(Röder et
al.,1998)
。
3.6
数据记录与分析
利用
AlphaView1.2.0.1
软件
(Alpha,
美国
)
进行
SSR
位点检测与分子量计算，所采用的分子量
Marker
为由单独制备的
PCR
产物混合而成的
D2000 (
北京天根
)
。根据国家水稻数据中心公布的
24
对
SSR
引物扩增所得的等位基因分子量及多态
性等信息，对比本实验所检测到的位点多态性，将
符合条件的条带视为
1
个等位基因并进行记录。根
据相同迁移位置上
(
即分子量相同的
DNA
片段
)
条
带分布情况对数据进行记录，有带时赋值为
1
，无
带时赋值为
0
的标准，全部转化为
1/0
格式。数据
采用
NTSYS2.10e
软件中
similar ity
程序计算相似系
数，以
clustering
程序中
SHAN
进行
UPGMA (
非加
权组平均法
)
聚类分析
(
马红勃等
, 2010)
。
作者贡献
王俊峰为本实验的主要构思和实施者，为论文初稿的主
要编写人员。李娜娜，张煜和马玉敏参与了部分实验的实施，
余华参与了实验数据的分析。姚方印提供了本实验的材料并
对实验实施进行了指导。丁汉凤为本文通讯作者，构思者及
负责人，指导论文写作、修改及定稿。全体作者都阅读并同
意最终的文本。
致谢
本文由山东省农业良种工程
(
主要农作物物种种质资源
的收集
,
鉴定与入库保存
, 2010LZ01
-
01)
和国家科技基础性
工作专项资金
(
山东省沿海地区抗旱耐盐优异性状农作物种
质资源调查
, 2007FY110500)
共同提供支持。
参考文献
Chen Y.H., Hou Y.M., Li H.Y., Li M.B., Yuan Y., and Xu Z.J.,
2009, Establishment of DNA fingerprinting and analysis
of genetic diversity among japonica rice cultivars attended
regional trials in northeast region of China, Zhongzi
(Seed), 28(3): 28-35 (
陈英华
,
侯昱铭
,
李宏宇
,
李茂柏
,
袁媛
,
徐正进
, 2009,
东北地区水稻区试新品种的
DNA
指纹图谱构建及遗传多样性分析
,
种子
, 28(3): 28-35)