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李爱贤等
, 2011,
分子生物学
技术在甘薯
(
Ipomoea batatas
(L.) Lam.)
遗传育种中的应用
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.106 pp.1766-1775 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0106)
1771
行转录表达。此外，
Tanaka
等
(2005)
利用
mRNA
差
异显示技术，在不同发育时期的甘薯块根中分离出
10
个与块根发育相关的基因
(SPF)
，通过半定量
RT-PCR
检测，其中
6
个在块根形成过程中表达量
增加，
3
个表达量减少，进一步研究表明，
SPF6
编
码类受体蛋白激酶
(RLK)
的分子结构和拟南芥
RLK
家族中的
LRRII
型比较相似。
随着研究的深入，甘薯块根
cDNA
文库建立起
来，直径为
0.3~1.0 cm
，用于鉴定与甘薯块根发育
相关的基因，数据分析表明
39
个表达序列标签
(EST)
与甘薯块根发育相关，根据
Northern
印迹结果，
22
个基因是在甘薯生长发育早期的块根和纤维根中
表达的
(You et al., 2003)
。
2.3
甘薯抗逆相关基因的分离与克隆
长期以来，甘薯基因分离和克隆的工作重点是
抗逆性相关基因的研究。
Wang
等
(2002)
从甘薯中分
离出了块根贮藏蛋白基因的启动子区，并证明其在
茉莉酸甲酯
(MeJA)
和感伤处理下强烈表达。
POD
、
APX
属于植物体中的抗氧化酶，在环境
胁迫下通过催化植物细胞中氧离子的岐化反应来
消除氧化胁迫。现已从甘薯中分离出了多个
POD
基因，通过
Northern
印染表明，它们在不同的非生
物胁迫下有不同的表达模式
(Jang et al., 2004)
。随
后，
APX
基因也从甘薯中分离出来，进一步研究表
明该基因在
ABA
、高盐、高温、
H
2
O
2
和病原菌侵
染等各种环境胁迫下会增强表达
(Park et al., 2004)
。
利用抗病基因的保守序列设计简并引物进行
同源扩增，并进行植物抗病基因同源序列
(RGA)
的
克隆研究在国内外已有大量报道
(
李春来和张怀渝
,
2004)
，近年来该技术已开始在甘薯抗病基因的分离
和克隆中得到应用。
甘薯羽状斑驳病毒
(SPFMV)
、甘薯
G
病毒
(SPVG)
、甘薯潜隐病毒
(SPLV)
是甘薯世界性的三大
病毒病。其中
SPFMV
危害最严重，可使甘薯严重
退化及减产，我国广大薯区每年由此造成难以估量
的损失。
Abad
等
(1992)
首次克隆测序了
SPFMV
的
外壳蛋白
(CP)
基因，为抗
SPFMV
基因的遗传转化
奠定了基础。利用克隆的
SPFMV-CP
基因可建立快
速、灵敏、特异性高的病毒检测手段，对于甘薯的
种薯生产、推广和脱毒具有重要的意义。孟清等
(2005)
根据国外已经克隆测序的
SPFMV
基因序列，
设计合成了一对特异性引物，成功克隆了
SPFMV
中国分离株外壳蛋白基因。
古英洪等
(2006)
根据已报道的
SPVG
外壳蛋白
基因序列设计引物，采用
RT-PCR
技术，从甘薯病
叶总
RNA
中克隆到两个约
700 bp
的
cDNA
片段，
序列测定与分析结果表明，该片段与已报道的
SPVG
基因具有较高的同源性，表明该片段是
SPVG-CP
基因。
Colinet
等
(1997)
最早克隆了
SPLV-CP
基因。随
后，黄玉娜和张振臣
(2007)
根据已报道的
SPLV-CP
基因序列设计引物，利用
RT-PCR
方法克隆了
SPLV
中国河南分离物
(SPLV-HN)
的
CP
基因及部分
3′
端
非编码区序列，由
879
个核苷酸组成。
甘薯茎线虫病是甘薯生产上的主要病害，对甘
薯生产构成了严重威胁，目前我国生产上推广面积
最大的徐薯
18
和南薯
88
均表现感病。柳哲胜等
(2006)
根据已报道的植物线虫抗性基因的核苷酸结合位点
保守氨基酸序列设计兼并引物，从甘薯中分离出了
与茎线虫病抗性相关的肌醇-
1
-磷酸合成酶基因。
和线虫病一样，根腐病也是我国甘薯最主要的
病害之一，林巧玲和曾会才
(2007)
以高抗根腐病的
徐薯
18
总
DNA
为模板进行
PCR
扩增，获得其
RGA
，对其氨基酸序列进行聚类分析和同源性比较
分析表明，这些
RGA
在结构上与己知的抗病基因
具有较高的相似性，它们很可能代表甘薯中不同类
型的抗病基因；所获得的
RGA
可做为分子标记筛
选甘薯的抗病候选基因，为甘薯的抗病基因克隆奠
定了基础。
3
甘薯遗传转化
植物遗传转化是指利用重组
DNA
技术、植物
细胞组织培养技术或种质系统转化技术，将外源基
因导入植物细胞或组织，经植株再生获得转基因植
株的技术。甘薯遗传转化研究工作开始较晚，但已
取得了较大进展。
大量研究表明，农杆菌介导的遗传转化，插入
的
DNA
片段明确、拷贝数低、遗传与表达稳定
(
王
景雪等
, 1999)
。早在
20
多年前，
Suseelan
等
(1987)
就论证了农杆菌可以侵染甘薯。此后，农杆菌广泛
用于甘薯遗传转化，如将甘薯叶片和愈伤组织与根
癌农杆菌共培养，诱导得到转化愈伤组织
(
朱宝成等
,
1992)
；用叶盘法获得甘薯转基因植株
(Newell et al.,
1995)
。
总而言之，甘薯遗传转化研究初期，所用的转
化受体主要是叶片、叶柄，另外还有子叶、茎、新
鲜块根、愈伤组织和原生质体；所使用的主要为根