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曾艳等 , 2011, 4 种水仙种质资源的 ISSR 和 AFLP 遗传多样性分析, 分子植物育种(online) Vol.9 No.105 pp.1759-1765 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0105)
1764
水仙花专业合作社。分别是漳州单瓣水仙、漳州重
瓣水仙、崇明重瓣水仙、崇明单瓣水仙、状元水仙、
洋水仙。洋水仙包括 4 个品种：胡德山 (Narcissus
‘ Paricutin’ ‘Mount Hood’) ，阳光光盘 (Narcissus
‘Sun Disc’)，帕里库廷火山( Narcissus ‘Paricutin’)和
塔希提(Narcissus ‘Tahiti’)。
3.2 水仙总 DNA 提取
采用 CTAB 法( 王慧超等, 2010) ，0.8% 琼脂糖凝
胶电泳上检测 DNA 质量，在紫外可见分光光度计上
测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光值，将符合实验要
求的 DNA 样品稀释至 50 ng/μL 于-20 ℃保存备用。
3.3 ISSR 反应体系优化
参照陈林姣(2006)提供的 20 μL ISSR 反应体
系。PCR 扩增反应在 PTC-100TM 和 PTC-200TM
扩增仪上进行。以崇明重瓣水仙 DNA 为模板，选
择单一引物，分别进行单因素优化和正交设计优
化，确定崇明水仙 ISSR-PCR 反应的最佳实验参数。
单因素优化分别设置了：6 个 DNA 模板浓度(分
别为 5 ng, 10 ng, 20 ng, 30 ng, 40 ng 和 50 ng)、6 个
Mg2+浓度(分别为 1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L,
2.5 mmol/L, 3.0 mmol/L 和 3. 5 mmol/L) 、 6 个引
物浓度( 分别为 0.2 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.4 μmol/L,
0.5 μmol/L, 0.6 μmol/L 和 0.7 μmol/L) 、6 个 Taq DNA
聚合酶浓度(分别为 0.4 U, 0.6 U, 0.8 U, 1.0 U, 1.2 U
和 1.4 U)、 6 个 dNTPs 浓度( 分别为 0.1 mmol/L,
0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.25 mmol/L, 0.3 mmol/L
和 0.35 mmol/L)；比较它们对 ISSR 反应的影响，均
重复两次。此外，实验在 40 ℃ ~60℃范围内设置了
12 个退火温度：40.0℃、40.5℃、41.7℃、43.2℃、
45.5℃、48.4℃、51.7℃、54.6℃、56.8℃、58.4℃、
59.6℃和 60 ℃，以筛选出最佳退火温度。
正交设计优化对 Mg 2+浓度、dNTPs 浓度、Taq
DNA 聚合酶浓度、引物浓度 4 个影响因素用 L9(3
4)
正交表设计( 表 5) ，每个组合重复 2 次。
表 5 ISSR-PCR 优化因素水平表
Table 5 ISSR-PCR optimization factors
水平 试验因素
Level Test factors
Mg2+
(mmol/L)
DNTPs
(mmol/L)
TagDNA
polymerase (U)
Prmier
(μmol/L)
1 1.5 0.1 0.5 0.4
2 2.0 0.2 1.0 0.5
3 2.5 0.3 1.5 0.6
3.4AFLP 分子标记
AFLP 酶切采用 Mse Ⅰ和 EcoRⅠ双酶切组合，
内切酶、T4 DNA 连接酶购自 NEB 公司。AFLP 接
头、引物、Taq 酶购自北京鼎国生物技术公司。反
应体系如表 6 所示。各反应完成后用 1.5% 的琼脂糖
凝胶电泳检测产物。
3.5 数据处理
人工读取 ISSR、 AFLP 电泳图，在同一引物、
同一位点处，对扩增产生信号较强的、重复性较好
的带记为“1”，信号较弱、重复性较差的带或未出
现带的记为“0”，形成 0 、1 矩阵。利用 NTSYS 统
计软件对统计结果进行分析，计算遗传相似系数
(GS)。根据遗传相似系数对供试水仙进行分析。
表 6 AFLP 标记反应体系
Table 6 Reaction systemof AFLP markers
酶切连接反应体系(20 μL) 预扩增反应体系(25 μL) 选择性扩增反应体系(25 μl)
System of enzyme digestion and
ligation (20 μL)
Reaction system of pre-amplifi-
cation (25 μL)
Reaction systemof selection amplification (25 μL)
组分 各成分体积(μl) 组分 各成分体积(μl) 组分 各成分体积(μl)
Component Volume of
component (μl)
Component Volume of
component (μl)
Component Volume of
component (μl)
DNAtemplate 4 DNAtemplate 2 The diluted sample amplification 2
Adapter 1 Pre-ampmix 1 MseⅠ primer 1
Eco RⅠ/MseⅠ 2 dNTPs 1 EcoRⅠ primer 1
10×Reaction Buffer 2.5 10×PCRBuffer 2.5 10×PCRBuffer 2.5
10 mmol/L ATP 2.5 Taq enzyme 0.5 dNTP 0.5
T 4 Ligase 1 ddH2O 18 Taq enzyme 0.5
ddH 2O 7 ddH 2O 17.5