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饶龙兵
, 2011,
冷杉基因组
DNA
遗传标记芯片的构建与分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.101 pp.1726-1734 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0101)
1732
280 nm
处测定其紫外吸收值，计算出
D
260 nm
/
D
280 nm
的比值。基因组
DNA
的完整性检测：取
2 μL DNA
提取液，加
3 μL
上样缓冲液
(
内含
0.25%
溴酚蓝
,
40%
蔗糖
)
，用
0.7%
琼脂糖凝胶
(
内含
0.5 mg/L
的
EB(
溴化乙锭
))
电泳，电泳缓冲液为
1
×
TAE
，电压
110 V
，电泳
40 min
后，紫外凝胶成像拍照
(
图
1)
。
3.2
冷杉基因组
DNA
不同组合酶切和不同引物扩增
效果
材料：上述几种冷杉基因组
DNA
。
方法：采用
7
种不同内酶切组合酶切基因组
DNA
。扩增引物
1
：采用
Pst
Ⅰ酶切对应引物，未
添加选择性碱基扩增，每种不同酶切组合处理
8
个
冷杉样品，见电泳图
2
；扩增引物
2
：采用
Pst
Ⅰ酶
切对应引物再添加
+CAG 3
个选择性碱基，每种不
同酶切组合处理
2
个冷杉样品，电泳图
3
。操作步
骤：取冷杉基因组
DNA 1 μL
加入酶切反应混合体
系进行酶切和接头连接。
(
酶切反应混合体系包括
:
Pst
Ⅰ及不同的酶切组合
,
Pst
Ⅰ人工接头
, BSA,
酶
切缓冲液
, T
4
DNA
连接酶
,
去离子水
)
。酶切时间如
下：
1
：
Pst
Ⅰ
+
Bst
N
Ⅰ先
37
℃
2 h
后
60
℃
2 h
；
2
：
Pst
Ⅰ
+
Taq
Ⅰ先
37
℃
2 h
后
60
℃
2 h
；
3
：
Pst
Ⅰ
+
Hae
3
37
℃
3 h
；
4
：
Pst
Ⅰ
+
Alu
Ⅰ
37
℃
3 h
；
5
：
Pst
Ⅰ
+
Msp
Ⅰ
先
37
℃
2 h
后
80
℃
20 min
；
6
：
Pst
Ⅰ
+
Hha
Ⅰ先
37
℃
2 h
后
80
℃
20 min
；
7
：
Pst
Ⅰ
+
Taq
Ⅰ
+
Mse
Ⅰ先
37
℃
3 h
再
60
℃
2 h
后
65
℃
20min
。酶切后产物添加
dNTP
、
DNA
聚合酶及
Pst
Ⅰ对应的引物、
PCR
缓
冲液，进行
PCR
扩增，扩增条件为
94
℃
1 min
、
60
℃
40 s
、
72
℃
50 s
共
30
个循环。扩增后的产物
用
1.2%
凝胶电泳检测。
3.3
基因组
DNA
芯片文库构建
芯片文库构建材料：芯片文库材料来源和库容
大小可以根据不同研究目的构建不同大小的文库。
如果建库材料来源比较广，而且库容比较大则可应
用于多种材料的样品检测。本试验建库材料包含有
元宝山冷杉
(
A. yuanpaoshanensis
)
、梵净山冷杉
(
A.
fanjinshanensis
)
、百山祖冷杉
(
A. besganzuensis
)
、资
源冷杉
(
A. ziyuanensis
)
、大院冷杉
(
A. dayuanensis
)
，
以及日本冷杉
(
A. firma S.et
)
，主要目的是为以后相
关材料检测准备。
芯片文库构建方法：基因组
DNA
提取采用前
法。取上述建库材料各样品的基因组
DNA 1 μL
加
入酶切反应混合体系，
60
℃温育
90 min
进行酶切和
接头连接。酶切后的产物在扩增反应混合液中
(
包括
PCR
缓冲液
, dNTP, DNA
聚合酶及
Pst
Ⅰ引物
)
进行
PCR
扩增，扩增条件
94
℃
1 min
，
60
℃
40 s
，
72
℃
50 s
共
30
个循环。将不同来源
(
材料
,
样品
)
的
PCR
扩增产物各取少量等量混合，然后利用
TOPO-TA
克隆法克隆。再将克隆转化物转到培养基中培养增
殖，增殖后的克隆菌落在扩增反应液中直接
PCR
扩
增
(
扩增反应液包括
:
扩增缓冲液
, dNTP, DNA
聚合
酶及
M13
前向引物和
M13
后向引物
)
。扩增条件
95
℃
4 min
，
57
℃
35 s
，
72
℃
1 min
，共
35
个循环。
PCR
扩增后的产物烘箱干燥，然后再用乙醇洗涤两
次，最后加入芯片点样缓冲液，利用芯片点样仪点
样载玻片上，每样品
4
次重复，点样后的载玻片上
经过
DNA
与基片高温再水合、紫外线交联固定及
干燥处理，制成一批遗传标记检测芯片，置于芯片
盒避光保存备用。
3.4
试测样品处理及与芯片杂交
试测材料来源及处理方法：待检
8
份材料来源
于梵净山冷杉野生群体。处理方法：提取样品基因
组
DNA
，经
Pst
Ⅰ
+
Taq
Ⅰ
+
Mse
Ⅰ限制性内切酶酶
切，再采用和前面文库构建相同的方法
PCR
扩增、
样品
DNA
沉淀、洗涤等处理。将处理过的样品
DNA
与荧光标记反应液混合标记样品
DNA (
荧光标记混
合液包括
dNTP, Klenow
酶
,
随机引物
,
缓冲液
)
。每
一待测样品均用两种不同荧光标记，作为标记重复。
芯片与试测样品的杂交及检测：将标记好的试
测样品
DNA
和杂交缓冲液混合，再使样品
DNA
高
温变性，变性好的混合液用吸头滴加到芯片上，盖
上盖玻片，置于一定湿度和温度的杂交仪中，杂交
12~20 h
。杂交后的芯片采用杂交清洗液依次洗涤。
洗涤后的杂交芯片用离心机甩干，再干燥，最后用
芯片扫描仪扫描，进行数据分析。由于每个克隆在
芯片上有
4
次重复，且每一待测样品均采用
2
种荧
光标记，故实际上每个样品信号值有
8
次杂交重复。
芯片点样采用
BioRobotics MicroGrid
点样系
统；芯片扫描采用
Tecan LS Reloaded
扫描系统。
3.5
芯片数据分析
信号数据分析参数及计算方法如下：为了检测
芯片点样质量和杂交信号质量，需要将每个杂交点
样
(
图
6C
为多个杂交样点杂交信号实际照片
)
，采用
分割法再分成多个信号检测点
(
图
6D
所示
)
分析，每
个信号检测点将有一个检测值，将这些被分割的检