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水生生物研究
, 2012
年
,
第
1
卷
,
第
1-6
页
Shuisheng Shengwu Yanjiu, 2012, Vol.1, 1-6
http://aor.5th.sophiapublisher.com
5
表
5
引物序列及扩增温度
Table 5 Primer sequences and annealing temperatures
微卫星引物
引物序列
(5′–3′)
退火温度
(
℃
)
SSR primer
Primer sequences (5′–3′)
Annealing temperature (
℃
)
P
-
01
F: AGGCCAGAAGGGACCATTTA
R: TGGTCGATCATTTTGCTGTG
64
P
-
04
F: CATGGTCTAGGCAGTGCTGA
R: GAGAGAACAGCCTCGCTGA
60
P
-
05
F: GCCACGTACTCGTGGTTCAT
R: GGAGGCTGTTTTCACGACTG
62
P
-
06
F: GCACCAGGAAAGAGTCAAGAA
R: CAGCCCGAGAACATCAGAAT
62
P
-
09
F: CAACCCAACTCTGCAGACAC
R: GAATTGCATGGAAGGCAGAT
64
P
-
10
F: AAAGCAGGGGAGAGAACAGC
R: CATGGTCTAGGCAGTGCTGA
64
P
-
11
F: GCACCAGGAAAGAGTCAAGAA
R: CAGCCCGAGAACATCAGAAT
62
P
-
12
F: ACGCAGGACCAAGAGTGAGG
R: TGTGCCACTCCCCGTATTGT
62
PS
-
04
F: AGTGAACCTTGCACATCCCAG
R: TCCAGTGAAGGTTCCAGACA
65
PS
-
11
F: ACCAGTCAGGAAAGTTGACAC
R: GCCAGTTTACCAAGAGATGGA
65
HLJZHB076
F: CACCGATTTCAGCACTAGCA
R: GGAGAAAGCTGGTGCCTATG
65
3.2
基因组
DNA
的提取
参照北京天根动物基因组
DNA
抽提试剂盒说
明书的方法提取样品基因组
DNA
。并用
8 mg/mL
(0.8%)
的琼脂糖凝胶电泳检测
DNA
质量，用紫外分
光光度计测定
OD
260
和
OD
280
，取出部分
DNA
样品将
浓度调至
50 ng/μL
，保存于-
20
℃备用。
3.3
微卫星引物
11
对引物
(
表
1)
皆来自文献
(
张志允等
, 2011;
魏
振邦等
, 2008)
，所有引物均由上海英潍捷基有限公
司合成。
3.4 PCR
扩增及产物检测
PCR
反应的总体系为
20 µL
：
50 ng
的基因组
DNA, 10
×
buffer 2 μL, MgCL
2
(25 mmol/L) 1.8 μL
，
4
×
dNTP (10 μmol/L) 0.5 μL
，上、下游引物
(20
pmol/L)
各
0.5 μL
，
Taq
酶
1 U
。
PCR
反应程序为：
94
℃
预变性
5 min
；
94
℃
30 s
，退火
(
退火温度依引物而
定
) 30 s
，
72
℃
30 s
，
30
个循环；
72
℃延伸
10 min
。
PCR
产物在
10%
的非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，
硝酸银染色。
3.5
数据统计分析
利用
Popgene32 (Version 1.31)
软件统计分析微
卫星基因座的等位基因数
(
N
a
)
、有效等位基因数
(
N
e
)
、观测杂合度
(
H
O
)
、期望杂合度
(
H
E
)
、
χ
2
检验
Hardy-Weinberg
平衡、遗传分化指数
F
-统计量
(F-statistics,
F
ST
)
及
Nei's
标准遗传距离
(
D
s
) (Nei,
1978)
。根据
Botstein
等
(1980)
的方法计算每个微卫星
位点的多态信息含量
(PIC)
。应用软件
MEGA 4.0
采
用
UPGMA
法进行聚类分析，以分析亲缘关系。
作者贡献
本论文第一作者刘阳对研究进行实施、数据整理以及
论文撰写。通讯作者朱新平对研究进行设计、指导和论文审
核修改。史燕、赵建、洪孝友参与本研究的采样、数据分析
等具体工作，周贵谭为本实验提供了宝贵的样品。
参考文献
Botstein D., White R.L., Skolnick M., and Davis R.W., 1980,
Construction of a genetic linkage map in man using
restriction fragment length polymorphisms, American
Journal of Human Genetics, 32(3): 314-331 PMid:6247908
PMCid:1686077