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张强等
, 2011,
玳玳花咖啡酸甲基转移酶基因的电子克隆及序列分析
,
分子植物育种
Vol.9 No.14 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0014)
1104
图
3
根据植物
OMTs
蛋白构建的系统进化树
注
: CaCOMT:
玳玳花
; AtCOMT:
拟南芥
; BpCOMT:
欧洲
白桦
; EgCOMT:
桉树
; RcOMT1:
月季
; RcOMT2:
月季
;
RcOMT3:
月季
; OOMT1:
玫瑰
; OOMT2:
玫瑰
; POMT:
月
季
; MsCOMT:
苜蓿
; IhCOMT:
鸢尾
; VpCOMT:
香草兰
;
CbCOMT:
仙女扇
; CbIEMT:
仙女扇
; NtOMT1:
烟草
Figure 3 Molecular phylogenetic trees based on the deduced
amino acid sequences of plant OMTs
note: CaCOMT:
Citrus aurantium
; AtCOMT:
Arabidopsis
thaliana
, ATU70424; BpCOMT:
Betula pendula
, FJ667539;
EgCOMT:
Eucalyptus gunnii
, AF168777; RcOMT1:
Rosa
chinensis
, AB086103; RcOMT2:
Rosa chinensis
, AB086104;
RcOMT3:
Rosa chinensis
, AB086105; OOMT1:
Rosa hybrida
,
AF502433; OOMT2:
Rosa hybrida
, AF502434; POMT:
Rosa
chinensis
, AB121046; MsCOMT:
Medicago sativa
, M63853;
IhCOMT:
Iris hollandica
, AB183825; VpCOMT:
Vanilla
planifolia
, AY555144; CbCOMT: Clarkia breweri, AF006009;
CbIEMT: Clarkia breweri, U86760; NtOMT1: Nicotiana
tabacum, X74452
(Clarkia breweri) COMT
和
IEMT ((iso) eugenol O-me-
thyltransferase)
的氨基酸相似性达到了
83%
，但两者
具有完全不同的底物选择特性，
IEMT
使丁香酚和
异丁香酚的甲基化生成芳香物质甲基丁香酚
(meth-
yleugenol)
和异甲基丁香酚
(isomethyleugenol) (Wang
et al., 1997; Wang and Pichersky, 1998)
。定点突变分
析
(Wang and Pichersky, 1999)
和分子模型研究
(Zubieta
et al., 2002)
揭示仙女扇
COMT
和
IEMT
几个底物绑定
残基的不同决定了底物选择特性的不同。通过序列
分析和同源比对，由于玳玳花
COMT
与上述基因间都
有较高的同源性，因此，我们推测玳玳花
COMT
可能
同时在木质素生物合成和花香物质代谢中起作用。
3
材料和方法
3.1
植物材料
玳玳花花瓣，取自苏州。
3.2
总
RNA
分离及
cDNA
第一链和第二链的合成
开花期取其未开放的花蕾。
RNA
的分离按照北京天根生化科技有限公司
RNAplant
植物总
RNA
提取试剂的说明书进行。
RNA
沉淀室温干燥
5~10 min
，用
DEPC
水溶解，-
75
℃保
存备用。
cDNA
第一链和第二链的合成参照
SMART
TM
PCR cDNA Synthesis Kit User Manual
方法进行。
3.3
玳玳花
OMT
序列片段的扩增
根据已知植物的
OMTs
基因信息，设计简并引物
OMT5
；
5'
-
ATGT(A/C/T)GG(A/T/C/G)GG(A/T/C/G)
GACATGTTT
-
3'
和
OMT3
：
5'
-
GT(C/T)CTCTC(T/C)
TTNCCHCC
-
3'
，引物由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。以玳玳花花瓣的
cDNA
为模板，用简
并引物
OMT5
和
OMT3
进行甲基转移酶的
PCR
扩增。
PCR
反应体系：
cDNA
模板
0.5 μL
，
10
×
PCR
缓冲溶液
5 μL
，
25 mmol/L
的
Mg
2+
4 μL
，特异引物
(20 μmol/L)
1 μL
，锚定引物
(20 μmol/L) 1 μL
，
10 mmol/L dNTPs
1 μL
，
Taq
酶
(5 U/μL) 0.5 μL
，加水到总体积
50 μL
。
PCR
程序：
94
℃预变性
3 min
；
94
℃变性
30s
，
50
℃
退火
30s
，
72
℃延伸
1 min
，
30
个循环；
72
℃延伸
7 min
，
4
℃保存。
PCR
产物用
AXYGEN
公司的
DNA
凝胶回
收试剂盒回收，回收的产物插入
pGEM-T easy
载体，
转化大肠杆菌，菌落
PCR
筛选阳性克隆。碱裂解法
抽提质粒，用
Eco
R
Ⅰ进行单酶切鉴定和
PCR
鉴定
后，重组质粒送上海博尚生物公司测序。
3.4
玳玳花
COMT
序列全长的电子克隆及
RT-PCR
验证
在同源克隆获得玳玳花
OMT
序列片段的基础
上，利用
blastn
搜索
NCBI
的
EST
数据库，下载检索
到的高相似性的
EST
序列，下载的
EST
进行第一次
拼接，得到一个叠连群
(contig)
；将此
contig
在
NCBI
的
EST
数据库上重新搜索匹配序列，并下载匹配序
列；再将匹配序列进行拼接，重复搜索、拼接，直
到不能再延伸为止，最后获得
1
个玳玳花
COMT
基因
的
cDNA
序列。设计引物
COMTW5
：
5'
-
ACAAAA