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李晓明等
, 2011,
雌雄异花甜瓜经
AgNO
3
诱导后的雄蕊发育和差异基因表达
,
分子植物育种
Vol.9 No.10 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0010)
1069
3
试材与方法
3.1
试材及处理方法
雌雄异花品系‘
RH107
’，日光温室育苗。
2~3
叶
1
心时，用
200 μg/LAgNO
3
水溶液喷施全株。喷
施后
4
、
12
、
24
、
48
和
72 h
分别取生长点，液氮速
冻后保存于-
80
℃备用。以喷施蒸馏水为对照。各
时间点设
2
次重复。植株开花后调查性型。
3.2 RNA
提取及
cDNA
合成
RNA simple Total RNA Kit (TIANGEN
公司
,
离心柱型
)
进行总
RNA
提取，
RQ DNase I (Promega
公司
)
消化残留的基因组
DNA
。根据测得的
RNA
样品浓度，将
RNA
分别等量混合，构建
2
个对照池
和
2
个处理池。
M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit
(TaKaRa
公司
)
用于双链
cDNA
的制备，步骤参照说
明书。
3.3 cDNA-AFLP
分析
使用
EcoR
I
和
Mse
I
两种限制性内切酶进行
cDNA
双酶切后连接接头，引物
E00
和
M00
用于预
扩增，接头为
EcoR
Ⅰ和
Mse
Ⅰ
Adaptor
。选择性扩
增引物
Mse
I 30
个和
EcoR
I20
个
(
各带
3
个选择性碱
基
)
，共计
320
个引物组合，用于选择性扩增，具
体参照刘志勇等
(2008)
的方法。
3.4
差异片段功能分析
挖带回收，加入
PCR
体系中，利用相应的引
物组合扩增差异条带，进行二次
PCR
扩增。切取
目标条带，
AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit
(Axygen
公司
)
回收特异片段，连接、转化，上海
生工测序。对获得的序列结果，应用在线
BLAST
程序，在
GenBank
核酸序列数据库或
EST
数据库中
搜寻同源序列，进行可能的功能分析。
3.5 RT-PCR
分析
以内参基因
CMACTIN
作为对照，选取
TDF
2
-
12
-
3
和
TDF 3
-
9
-
1
作为
RT-PCR
验证的片段，设计
合成特异性引物
(
表
2)
，由
Invitrogen
生物工程公司合
成。利用
Superscript (Invitrogen)
逆转录酶，以
Oligo dT
(18)
为逆转录引发引物，逆转录合成
cDNA
第一链。
表
2
用于
RT-PCR
的引物及序列
Table 2 Primers and their sequences used in semi-quantity RT-PCR
引物代号
Primer No.
序列
(5'
-
3')
Sequences (5'
-
3')
退火温度(℃)
Anneal temperature (
℃)
CMACTIN- F
ATTCTTGCATCTCTAAGTACCTTCC
53
CMACTIN- R
CCAACTAAAGGGAAATAACTCACC
TDF 2
-
12
-
3
-
L
GAGTCCTGAGTAATGGAGG
50
TDF 2
-
12
-
3
-
R
GTGTTGCGGGACTGGTTG
TDF 3
-
9
-
1
-
L
CTGCGTACCAATTCGAATC
50
TDF 3
-
9
-
1
-
R
GGGACTTACTCAGGACTCA
作者贡献
李晓明是实验设计和实验研究的执行人，并主要负责论
文写作；刘志勇是实验设计人，同时指导数据分析；冀瑞琴
指导数据分析并提供实验引物；魏鹏参与论文写作；冯辉是
项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写
作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家科技支撑计划
(2006BAD01A07)
、辽宁省
教育厅博士访学计划
(
辽教发【