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李晓明等
, 2011,
雌雄异花甜瓜经
AgNO
3
诱导后的雄蕊发育和差异基因表达
,
分子植物育种
Vol.9 No.10 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0010)
1066
同控制雄蕊发育的网络系统中的某一个或几个关
键点上，但是到底发生在性别决定基因的上游还是
下游，以及如何对雄蕊发育过程进行影响的，目前
这些机制尚不清楚。
近年差异表达基因研究方法不断丰富和完善，
Northern
杂交、实时定量
RT-PCR
、表达序列标签
(Expressed sequence tags, ESTs)
、
mRNA
差异显示
技 术 、 抑 制 差 减 杂 交
(Suppression subtractive
hybridization, SSH)
、基因芯片
(Gene chip)
等等，使
得人们能够从转录水平对差异表达基因进行分离
和功能鉴定。
cDNA-AFLP
是以
AFLP
为基础的基于
目的片段长度的
RNA
指纹分析技术，合适的酶切组
合几乎可以检测所有表达的基因，具有重复性好、
假阳性率低等特点
(Bachem et al., 1996)
，已被广泛
用于差异表达基因的分离和鉴定、基因表达特性等
方面的研究，在分离芥菜
(Fusco et al, 2005)
、大麦
(Leymarie et al, 2007)
、番茄
(Frank et al., 2009)
等作
物发育和逆境响应相关基因方面发挥了巨大作用。
本部分试验以
AgNO
3
处理雌雄异花甜瓜生长
点，诱导甜瓜雌花雄蕊发育，利用
cDNA-AFLP
基因
差异表达技术分离与性别分化相关的特异表达转
录衍生片段，为进一步克隆相关基因、揭示甜瓜性
别分化分子机理奠定基础。
1
结果与分析
1.1 AgNO
3
处理对甜瓜性型的影响
雌雄异花试材‘
RH107
’经
200 mg/LAgNO
3
处
理后，对性别表达产生影响，表现为“促雄”作用，
即在基部的
1
-
4
朵雌花中生长了
3
-
5
枚雄蕊，性别由
雌花转变成两性花
(
图
1)
。
AgNO
3
处理对雄花数目和
节位无显著影响。
1.2 cDNA-AFLP
分析
320
个引物组合进行选择性扩增，在处理池和
对照池间所扩增出多态性片段为
131
个，占
TDF
总数
的
2.2%
，每对引物平均扩增出差异
TDF
为
0.40
个。
在差异
TDF
中增强表达
21
个，占总数的
16.0%
；特
异表达
37
个
(
图
2)
，占总数的
28.2%
。另外
73
个
TDF
在
AgNO
3
诱导下表达被抑制，占总数的
55.7% (
图
3)
。
1.3
差异表达片段克隆测序及序列分析
选取典型的特异表达和抑制表达
TDF 28
条进
行回收和二次
PCR
扩增。多数引物组合产物分子量
图
1
雌花经
AgNO
3
诱雄后雄蕊发育
注
: 1
对照
; 2
处理
Figure 1 Morphology of the developed stamens in a female
flower reduced with AgNO
3
Note: 1 Control; 2 Treatment
与预期结果相同，而且为单一条带。少数引物组合
出现非特异性弱带，此时切取主带回收，通过
T-A
连接到
pGM-T
载体，重组质粒转化大肠杆菌
TOP10
后，经菌体
PCR
扩增后挑选阳性测序，共得到
16
个
有效序列。利用
NCBI
的
BLAST
工具与
dbEST
数据
库，进行特异表达基因同源性比较以及功能预测，
结果显示，
6
个与已知生物学功能的片段具有较高
同源性，其中分别涉及代谢
(TDF2
-
12
-
3, TDF3
-
11
-
6,
TDF3
-
4
-
2)
、信号传导以及细胞膜运动
(TDF2
-
9
-
4,
TDF3
-
9
-
1)
、转录调控
(TDF4
-
13
-
6)
，
7
个
TDF
具有
较高同源性但缺少生物学功能，
3
个在
NCBI
中未找
到同源序列
(
表
1)
。
1.4 RT-PCR
分析
为进一步验证
cDNA-AFLP
结果的可靠性，对部
分差异表达的
TDF
进行了半定量
RT-PCR
验证。结果
表明，
TDF 2
-
12
-
3
和
TDF 3
-
9
-
1
在
Ag
+
作用下被诱导
表达，
RT-PCR
和
cDNA-AFLP
结果吻合
(
图
4)
，该方
法所得结果可靠。
2
讨论
Beyer
等
(1976)
认为
Ag
+
是乙烯作用的竞争性抑
制剂，能抑制乙烯的部分氧化代谢途径，进而抑制
乙烯原初反应，最终抑制黄瓜雌花产生。汪俏梅、
戚艺军等
(1997; 2004)
认为
Ag
+
作为乙烯生物活性抑
制剂而抑制乙烯活性，可能是通过竞争结合细胞上
乙烯受体蛋白，起到削弱或降低乙烯作用的效果，
从而诱导苦瓜性型雄化。对于拟南芥乙烯受体研究