昆虫分子生物学研究
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
2
篇
,
第
8
-
15
页
Kunchong Fenzi Shengwuxue Yanjiu (Online), 2012, Vol.1, No.2, 8
-
15
13
3
材料与方法
3.1
菌株及培养基
本实验利用
31
株筛选自黑龙江凉水国家自然
保护区土壤中的
Bt
野生型菌株，编号为：
S2331
-
1
、
S2343
-
2
、
S2384
-
1
、
S2386
-
4
、
S2404
-
3
、
S2412
-
2
、
S2472
-
3
、
S2480
-
1
、
S2490
-
1
、
S2540
-
1
、
S2663
-
2
、
S2685
-
1
、
S2689
-
1
、
S2718
-
3
、
S2734
-
1
、
S2737
-
3
、
S2790
-
2
、
S2796
-
2
、
S2809
-
1
、
S2850
-
1
、
S2852
-
1
、
S2852
-
2
、
S2852
-
3
、
S2852
-
4
、
S2852
-
5
、
S2853
-
1
、
S2886
-
2
、
S2944
-
3
、
S2966
-
1
、
S2966
-
2
、
S2968
-
1
。
实验中
LB
培养基用于
Bt
菌株的活化培养，
G-Tris
培养基用于促进
Bt
菌株芽孢及伴胞晶体的产生
(
Aronson and Thompson, 1971)
。
BP
培养基在分析菌
株的
ICPs
随时间的变化时使用
(
谢柳等
, 2009)
。
Bt
菌株在
30
℃下进行恒温培养。
3.2
伴胞晶体显微镜观察
按照
Xie
等
(2010)
和
Liu
等
(2011)
的实验方法对
Bt
菌株进行伴胞晶体观察。该实验方法利用石碳酸
能够对正处在芽孢期的
Bt
的细胞进行染色，在光学
显微镜
(
Nikon YS100)
的油镜下就可以进行相应的
形态观察。
3.3
伴胞晶体扫描电镜观察
按照
Zhang
等
(2010)
的方法，取部分已经产生
了芽孢的
Bt
菌液，置于
EP
管中，反复洗涤，悬浮，
取
2
μL
的悬浮液涂抹在干净的载玻片上，锇酸熏蒸，
固定到扫描电镜
(
HITACHI S
-
3400
N)
的载物台上，
抽真空，重金属染色，观察、拍照。
3.4
菌株生长曲线的测定
按照
zhang
等
(2010)
的方法菌株活化接种。
30
℃，
230
r/min
摇菌，按
1%
转接
LB
培养基，
30
℃，
230
r/min
振荡培养，每过
2
h
就取
1
mL
菌液到离心管中，对
照为
HD
-
73
，
空白对照为
LB
培养基，测定
OD 600 nm
的吸光值，当
OD
值大于
0.8
时，进行一次稀释。
3.5
菌株蛋白的提取以及
SDS-PAGE
分析
按照
Jiang
等
(2008)
的方法，
Bt
菌株在
200
mL
的
G-Tris
培养基中培养
96
h
，
然后
8 000
r/min
，
4
℃，
离心
15
min
，
再使用
1
mol/L Nacl
溶液洗涤，洗涤后
12 000
r/min
，
4
℃离心
10
min
，
弃上清，收集沉淀，
溶于
30
mL
磷酸缓冲液中，超声波
(85
w) (model VC
-
130,
Sonics and Materials Inc, USA)
破胞处理
30
min
，
再
次
12 000
r/min
，
4
℃离心
10
min
，
收集沉淀，再使用
1
mol/L Nacl
溶液进行洗涤，洗涤后再次
12 000
r/min
，
4
℃离心
10
min
，
弃上清，收集沉淀，溶于
30
mL
磷
酸缓冲液中，进行超声波
(85
w)
破胞处理
30
min
，
收
集沉淀，溶于无菌水中，置于-
20
℃冰箱中保存。
SDS-
PAGE
的具体实验步骤按照