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昆虫分子生物学研究(网络版), 2012 年, 第 1 卷, 第 1 篇, 第 1- 7 页
Kunchong Fenzi Shengwuxue Yanjiu (Online), 2012, Vol.1, No.1, 1- 7
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3.3 家蚕组织器官材料的收集
分别于接种 BmCPV 后 24 h 、48 h 和 72 h， 将
感染 BmCPV 组和对照组家蚕幼虫在冰上解剖，分
别收集血淋巴、中肠、脂肪体、生殖体以及丝腺。
血淋巴样品立即加入到适量的 Trizol 中，其它组织
则用生理盐水(RNAse-free 水配制)漂洗，用滤纸吸
除水滴后迅速投入到液氮中冰冻，然后放入-70℃冰
箱保存备用。
3.4 家蚕各组织器官总 RNA 提取
按照 Trizol 试剂盒说明书步骤，分别用 Trizol
试剂提取感染 BmCPV 组和对照组家蚕的生殖体、
血淋巴、丝腺、脂肪体及中肠组织总 RNA。用分光
光度计检测各种组织样品总 RNA 浓度和纯度，最
后放入-70℃保存备用。
3.5 扩增引物设计
根 据 本 实验 室 基 因芯 片 实 验筛 选 获得
的 Bm3HAD 基因 EST 序列为模板，利用
Pr imer Premi er 5 . 0 软件设计目的基因 PCR
特异性引物。 5’ RACE 引物序列为 5’-AGCCCA
TTAGACCACCTCCAATAACC-3’， 3’ RACE 引物
序列为 5’-CTCAGCAGGGTCGCAAAGAAGATGTA-3’。
荧光定量 PCR 正向引物序列为 5’- AGGT
GGTCTAATGGGCTCCG-3’ ， 反向引物序列
为 5’-GGTTTGTGCCAATGCTCTTC-3’ ；内 参 照
β-ac tin 基因的正向引物序列为 5’- AATGGC
TCCGGTATGTGC-3’ ， 反 向 引 物 序 列 为
5’- TTGCTCTGTGCCTCGTCT-3’ 。
3.6 Bm3HAD 基因的 5’端与 3’端 RACE 扩增及
产物纯化
按照 SMARTTM RACE cDNA Amplification kit
试剂盒说明书，以 1 μg 家蚕中肠组织 RNA 为模板
反转录 cDNA 第一链。用 Tricine-EDTA 缓冲液稀
释合成的 cDNA 第一链，按照 SMARTTM RACE
Advantage cDNA PCR 试剂盒说明书，扩增 Bm3HAD
基因的 5’端与 3’端序列。
5’端 RACE 反应体系(25 μL)：5’端 cDNA 模板
1.25 μL ， dNTP Mix 0.5 μL ， 50×Advantage 2
polymerase Mix 0.5 μL， 5’端特异性引物 0.5 μL,
10×advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL，PCR-Grade water
17.25 μL，UPM (10×) 2.5 μL。3’端 RACE 体系(25 μL)：
3’端 cDNA 模板 1.25 μL、 3’端特异性引物 0.5 μL，
其余组分与 5’端 RACE 体系同。
PCR 反应程序：94 ℃预变性 2 min， 94℃变性
30 s ，60 ℃退火 30 s, 72℃延伸 10 min， 30 个循环。
取 10 μL 扩增产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳检测目
的条带。
图 5 Bm3HAD 在蚕体各组织的相对表达水平及 BmCPV 感
染导致的差异表达
Figure 5 Relative expression analysis of Bm3HAD in different tissues
and its differential expression inBmCPV-infected silkworm.
图 6 Bm3HAD 在 BmCPV 感染中肠的相对表达水平
Figure 6 Relative transcript level of Bm3HAD in BmCPV-infected
midgut of silkworm
按照胶回收试剂盒说明书步骤回收目的条带，
与 pGEM–T Easy载体连接，并转化DH10B感受态细
胞进行蓝白斑筛选，挑取有插入片断的阳性克隆进
行测序。
3.7 Bm3HAD 的生物信息学分析
克隆获得的 cDNA片段经测序后，利用NCBI上
的在线软件 Vecscreen (screen sequence for vector
contamination) 去除载体序列。用 Blastx 和 Blastn
(NCBI,http://www.ncbi.nlm.gov/) 进行同源性搜索，
利用DNAMAN拼接软件将获得的5’端序列、3’端序
列及该基因的EST序列拼接成Bm3HAD基因的全长
cDNA 序列。利用 Blastn 将 Bm3HAD 基因的全长
cDNA 序列与家蚕基因组比对，获得该基因全长
cDNA 所 在 家 蚕 基 因 组 序 列 的 登 录 号 为 ：
BABH01027674.1 ， 分析基因序列结构；采用
ExPASY (expert protein analysis system) 的ProtParam
软件预测该基因编码蛋白质的一级结构。