基因组学与生物技术
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
4
篇
,
第
22
-
26
页
Jiyinzuxue Yu Shengwu Jishu (Online), 2012, Vol.1, No.4, 22
-
26
http://gb.5th.sophiapublisher.com
25
表
3
实时定量
RT-PCR
验证
3
个基因差异表达
Table 3 Differential expression of three genes validated by quantative real-time PCR.
基因库序列号
GenBank accession
基因符号
Gene symbol
芯片结果
Results from Microarray
实时定量
PCR
qRT-PCR
XM_001066439
LOC686076
4.4
7.3
NM_022214
Cxcl6
-
36.4
-
14.3
NM_144755
Trib3
6.5
1.32
抑制蛋白激酶
A
活性来参与代谢综合征
(Bi
et al.,
2008)
。
CXCL6
除了参与炎症免疫反应和信号转导
之外，最近发现能够调节多巴胺能神经元的发育，
包括神经元的增殖，神经发生以及分化
(Edman et al.,
2008)
，
芯片检测显示
Cxcl6
基因在
10
天与第
6
天
之间转录表达下调
36.4
倍之多，
PCR
检测下调达到
14.3
倍。这一结果暗示
Cxcl6
基因的表达很可能对
精原干细胞的发生与增殖起负面影响。这有待以后
的研究工作进一步验证。
通过大鼠精原干细胞早期发育过程中第
10
天
与第
6
天睾丸组织基因芯片的检测结果，得到大量
功能各异的差异表达的基因，尽管这些差异表达基
因的功能和作用机制还有待进一步研究，但至少可
以得到以下结论：第一，大鼠青春期前睾丸发育过
程中第
6
天至第
10
天是非常关键的时期；第二，
精子发生早期的生物学过程是通过数以千计的基
因表达特定的蛋白而起作用的；第三，大鼠精原干
细胞早期发育过程，是一个多基因参与的过程。这
些结果为我们下一步研究精子发生的分子机制提
供了新的思路和信息。
3
材料与方法
3.1
实验动物与样品
实验用大鼠
(
Rattus norvegicus
)
取三月龄的
Wistar-Iamichi
雄性大鼠一只，雌性大鼠两只，体重
约
250 g
，合笼
,
自然交配。在内蒙古大学哺乳动物
生殖生物学与生物技术教育部重点实验室国家二
级清洁型动物房饲养，每周换垫料一次，保证饲料
和饮水的清洁和充足。新生大鼠出生当日定为第
1
天，
分别取出生后第
6
天和第
10
天的雄性大鼠，颈椎脱
位处死后，取睾丸组织样品，提取总
RNA
。
3.2
芯片杂交分析
分别收集大鼠出生后第
6
天和第
10
天睾丸组织
样品，按照
Trizol
试剂
(Invitrogen)
的标准操作抽提总
RNA
。
RNA
浓度和纯度分别用
Nanodrop ND
-
1000
和甲醛变性凝胶电泳检测，制备
cDNA
，用
NimbleGen One-Color DNA Labeling
试剂盒标记
cDNA
样品，通过
NimbleGen
杂交系统将
cDNA
样品
与大鼠
12×135K
芯片探针进行杂交。杂交和清洗之
后，用
Axon GenePix 4000B
芯片扫描仪进行扫描。
本文所有芯片原始数据均上传至
GEO
公共数据库
中，序列号为
GSE29666
。
3.3
实时定量
RT-PCR
验证
按总
RNA
提取试剂盒说明
,
提取大鼠睾丸组织
总
RNA
，根据各样品总
RNA
的浓度，取相同质量
的各组样品按照
M-MLV
反转录酶说明书进行反转
录反应。利用
cDNA
为模板进行
实时定量
PCR
反应。
我们从基因芯片的结果中选择了
3
个差异表达
的基因，采用
SYBR Green
Ⅰ荧光染料法进行实时
荧光定量
PCR
扩增
,
检测它们在出生后第
10
天与第
6
天的转录表达水平。每个基因的实时定量
PCR
检测
在
Bio-Rad Chromo4
TM
实时
PCR
检测仪上重复三
管。实时定量
PCR
引物见表
4
。数据分析通过
MJ
Opticon Monitor
分析软件
(Bio-Rad)
完成。计算方
法用
2
-ΔΔCt
法。
Gapdh
做内参基因，
H
2
O
作阴性对照。
所有
PCR
产物的分子量通过琼脂糖凝胶电泳验证。
表
4
实时定量
PCR
引物序列及参数
Table 4 Primer sequences and real-time PCR parameters.
基因名称
Gene name
引物序列
Primer sequences
退火温度
(
℃
)
Annealing temperature (
℃
)
产物大小
(bp)
Product size (bp)
Cxc16
PF: GATCGCTAATTTGGAGGTGAT
PR: TCTTTATCAACGGAGCTTGTG
58
119
Loc686076
PF: GAAGACCCTTACAACTGTCCAA
PR: GTCACCCTGTAGCTGAATGACT
58
142
Trib3
PF: GTCGATTTGTCTTCAGCAACTG
PR: CTGAGTATCTCTGGTCCCACAT
59
139
Gapdh
PF: GCAAGTTCAACGGCACAG
PR: GCCAGTAGACTCCACGACAT
55
140
