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基因组学与医学生物学
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
7
-
17
页
Jiyinzuxue Yu Yixue Shengwuxue (Online), 2012, Vol.1, 7
-
17
http://gmb.5th.sophiapublisher.com
12
究者对转基因疫苗可商业化前景的关注。此后，与
CTB
同源的热易变毒素
B
亚基
(LTB)
与热稳定毒素
(ST)
的融合蛋白在烟草叶绿体中表达，对小鼠的口服
免疫检测显示：血清和粘膜中的
LTB-ST
抗体不只对
霍乱病毒有免疫效应，使小鼠肠液积累量减少，而且
对由大肠杆菌引起的腹泻疾病有广谱抵抗作用
(Rosales-Mendoza et al., 2009)
。近来，又有
CTB-AMA1
(
疟疾抗原顶端膜蛋白
1)
和
CTB-MSP1 (
疟疾裂殖子表
面蛋白
1)
两种
CTB
融合蛋白在烟草和莴苣叶绿体成
功表达，二者均可诱导产生霍乱病毒和疟疾双重免
疫，其中在口腔中对霍乱病毒显示完全免疫
(Davoodi-semirmi et al., 2010)
。此外，也有研究者将
犬细小病毒
(CPV)
，口蹄疫病毒
(FMDV)
基因分别与
CTB
构建融合基因转化烟草、衣藻叶绿体获得转化子
(
吕海丹等
, 2010)
。
(2)
破伤风，白喉和百日咳
—DPT
：
DPT
是当今世界
最流行的三种疾病。
2003
年，
DPT
的世界平均覆盖率达
78%
，其中有
270
万孩子不能获得
DPT
疫苗，而南亚地
区和撒哈拉以南非洲地区就达
195
万
(WHO, 2008,
http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/2004_r
eport_update/en/index.html)
。目前
DPT
疫苗的生产程序繁
杂，成本高价，使用时存在对一些抗毒素过敏等副作用。
而叶绿体转化技术为生产廉价的
DPT
疫苗带来契机，一
种包含破伤风、白喉、百日咳三种抗原决定簇的
DPT
杂
合蛋白在烟草叶绿体高效表达，可达
0.8%TSP
。在喂食
小鼠干燥的叶片时发现：小鼠血清和粘膜组织中，具有
功能性
IgG
和
IgA
抗体
(Soria-Guerra et al., 2009)
。
炭疽病作为一种由炭疽杆菌引起的人畜共患传
染病，危害性极强。例如，
2011
年
8
月， 我国辽宁
鞍山市海城、岫岩地区发生严重炭疽病疫情。
(http://bjrb.bjd.com.cn/html/2011-08/26/content_444250.
htm?div=-1)
。目前，该病主要通过注射疫苗来预防。
而目前市场上的炭疽疫苗具有一定的副作用，会引起
受体局部疼痛和肿胀等甚至类似于感冒样的症状。叶
绿体转化技术的发展有助于抑制这种生物恐怖，一种
保护性抗原
(PA)
通过将
pagA
基因插入烟草叶绿体基
因组而成功表达，并被证明可使小鼠获得高水平的
IgG
，在免疫测试中，
100%
小鼠幸存。据评估：一英
亩的这种转基因烟草大概可生产
3.6
亿剂炭疽疫苗
(Watson et al., 2004; Koya et al., 2005)
。最近，
Gorantala
等
(2011)
将
[PA(dIV)]
基因导入烟草叶绿体也获得炭疽
疫苗抗原，并首次进行了口服免疫测试。
在提到的所有疾病中，疫苗无论是口服还是皮下
注射，免疫效果都难达到
100%
。欲使叶绿体转化更
好地应用于疫苗抗原的生产还需进一步的研究。
3
叶绿体遗传转化技术表达外源蛋白存在的问
题与挑战
相对于核转化，叶绿体转化技术虽独辟蹊径，提
供了新型环保疫苗的表达平台，但仍有许多不可忽视
的问题制约着该技术在应用方面的扩展。
3.1
多效性
已有报道证实叶绿体转化中外源基因的表达会
产生多效性
(Tregoning et al., 2003; Hasunuma et al.,
2008; Tissot et al., 2008)
，包括雄性不育、黄叶、发育
不良等，但其显然不是蛋白过量积累的结果。因为
Ruhlman
等
(2010)
实现了一种
CTB-Pins
融合蛋白的超
表达，表达水平达
72% TLP
，却没有任何负效果；而
Oey
等
(2009)
发现细胞溶解酶的超表达严重影响了植
物的生长。
Pelletier
和
Budar (2007)
提出了多效性可能
是一些因素干涉到机体胞质代谢相关基因的正常读
码，或造成
ATP
的低效生产而造成的。为了克服这种
负效果，未来的研究需在与叶绿体相关的代谢途径和
发展叶绿体诱导表达系统来避免这种不利影响等方
面作出努力。
3.2
诱导表达系统
叶绿体诱导表达系统的发展为避免转基因表达
的多效性带来希望。
Lössl
实验室为避免烟草叶绿体
中使用
phb
操纵子造成的雄性不育现象，使用了乙醇
诱导控制系统，主要通过向转基因植物喷洒
5%
乙醇
诱导核基因组表达
T7 RNAP
，进而调控
phb
操纵子的
转录
(Lössl et al., 2005)
。但这种诱导系统需要细胞核
和叶绿体两部分转基因的表达，背离了叶绿体转化基
因不随花粉漂移的优点。
IPTG (ß-
异丙基硫代半乳糖
苷
)
诱导系统的出现很好的解决了上述问题。它基于
lacZ
阻遏物对转基因质体表达的调节，是一种完全的
质体转基因表达，无基因扩散的安全忧虑
(Mühlbauer
and Koop, 2005)
。也有研究者将不被叶绿体内源性转
录因子识别的真核启动子置于叶绿体表达载体中，通
过提供一种能够与叶绿体编码的质体
RNA
聚合酶相
互作用的嵌合转录因子，特异性的启动转录实现诱导
控制
(Buhot et al., 2006)
。近来，
Verhounig
等
(2010)
尝
试了一种较易调控的诱导系统：以茶碱为外源配体，
诱导合成一种核糖开关作为质体表达必须的翻译调
控因子，成功实现调控。叶绿体中外源基因高效表达