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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1346
-
1353
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1346
-
1353
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1347
研究背景
芥蓝
(
Brassica oleracea
L. var.
alboglabra
Bailey)
是我国南方特产蔬菜，以秋冬生产为主，收获期是齐
口期，即抽薹开花始期，此时植株正经历营养生长
向生殖生长的转换，受温光环境因素影响很大，如低
温利于春化作用诱导齐口期，而高温则阻滞生长、降
低菜薹产量和品质等
(
关佩聪和梁承愈
, 1989;
杨暹
和杨运英
, 2002;
刘厚诚等
, 2003)
，因此，齐口期不
但是生产上常用的品种分类标准，也是育种和种质
资源鉴定的重要指标。
通过模式植物拟南芥的研究发现，春化诱导开
花与微量的短暂的
DNA
甲基化水平降低相关
(Burn
et al., 1993; Finnegan et al., 1996; 1998; Sheldon et al.,
2000)
，
DNA
甲基化水平降低也能够诱导白菜、菜心、
萝卜和青花菜等的抽薹开花
(
李梅兰等
, 2002; 2003;
汪炳良等
, 2005;
王薇等
, 2008;
于锡宏等
, 2008)
。有
研究认为
DNA
甲基化作为表观遗传的重要形式，
参与春化途径调控并可能起着整合因子作用
(Sheldon et al., 2000)
，也有研究认为
DNA
甲基化水
平降低和春化作用是通过不同的调控途径诱导开
花时间关键基因
FLOWERING LOCUS C
(
FLC
)
下调
表达的
(Finnegan et al., 2005)
。
检测甲基化的诸多方法中，
MSAP (methylation
sensitive amplified polymorphism)
与
AFLP
原理相
同，如两者均无需了解全基因组序列信息，采用长
寡核苷酸随机引物进行
PCR
反应，利用聚丙烯酰胺
凝胶进行产物分离，既保留
RFLP
的可靠性又保留
PCR
的精确性和高效性，成为多态性检测效率非常
高的分子标记技术。不同之处是
MSAP
选用
HpalI
和
MspI
酶切
DNA
，这对同裂酶能够检测基因组
DNA
上
CCGG
位点的胞嘧啶甲基化状态
(McCle-
lland et al., 1994)
，结果
MSAP
既能象
AFLP
一样检
测基因组
DNA
的序列差异，又能检测由非序列变
化引起的表观遗传差异，演变成一种结构与功能相
结合的分子标记，在十字花科植物研究上得到广泛
应用，如拟南芥、白菜、油菜、萝卜的发育调控、种
质资源鉴定、抗逆性或多倍化后代的甲基化分析
(Cervera et al., 2002;
陆光远等
, 2005,
科学通报
,
50(24): 2750-2756;
齐心
, 2006;
李象松等
, 2010;
Salmon et al., 2008)
，但在芥蓝种质资源鉴定上还没
见报道。由于芥蓝种质资源狭窄，齐口期易受环境
因素影响，常规的分子标记技术仅能检测出基因组
结构变异，为此本研究利用
MSAP
检测
18
个芥蓝
DNA
甲基化水平，分析齐口期表观遗传多样性，探
讨
DNA
甲基化对齐口期的影响，旨在为芥蓝育种
和栽培生产提供理论依据。
1
结果分析
1.1
芥蓝齐口期分析
18
份芥蓝齐口期和叶片数的调查结果如下
(
表
1)
，
齐口期最少为
35 d (
澄海芥蓝菜和大丰芥蓝
)
，最多
的
75 d (
正源澄海粗条芥蓝
)
，多数品种为
40~60 d
，
平均为
50 d
。齐口期叶片数最少的为
8
片
(
正源四季
甜芥蓝
,
白花尖叶粗苔甜芥蓝
,
甜脆黄花尖叶芥
蓝
)
，最多的为
15
片
(
泰国芥蓝
)
，平均叶片数为
10
片。
齐口期和叶片数相关系数为
0.296
，两者不相关，即
叶片数不随齐口期变化。变异系数表示性状离散性
特征，高值代表性状离散程度大，本研究中的齐口
期为
21%
，叶片数为
18%
，表明齐口期变异程度大
于叶片数。
根据
18
个芥蓝的齐口期和叶片数，利用
DPS
数据处理系统计算遗传距离，变化范围是
0~40
，平
均值为
12.227 6
。正源澄海粗条芥蓝和澄海芥蓝菜的
遗传距离最大
(40)
，香港白花甜芥蓝和正源大笋黄
花芥蓝、正源四季甜芥蓝和绿宝芥蓝，白花尖叶粗
苔甜芥蓝和甜脆黄花尖叶芥蓝的遗传距离最小，表
明几个品种亲缘关系最近。
利用欧式距离和类平均法进行聚类分析
(
图
1)
，
在遗传距离
10.62
处分为
3
类，第一类是齐口期为
35~50 d
之间的品种，包括白花甜芥蓝、甜脆白花
尖叶芥蓝、泰国中迟花粗茎尖叶芥兰、香港白花甜
芥蓝、正源大笋黄花芥蓝、中花芥蓝、顺宝芥蓝、
白花尖叶粗苔甜芥蓝、甜脆黄花尖叶芥蓝、大丰芥
蓝和澄海芥蓝菜。第二类是齐口期为
55~60 d
的品
种，包括正源大笋香菇芥蓝、大芯四季香菇芥蓝
104
、正源大笋迟花芥蓝、泰国芥蓝、正源四季甜
芥蓝和绿宝芥蓝。第三类为齐口期
75 d
的正源澄海
粗条芥蓝。
1.2
芥蓝
MSAP
分析
利用
5
对
MSAP
引物组合扩增
18
个芥蓝品
种，一共得到
432
条带，平均每条引物
86
条，其
中
201
条片段表现出多态性，推测芥蓝甲基化多
态性比率为
47% (201/432)
，可见
MSAP
检测芥篮
种质资源遗传多样性的效率很高，芥篮遗传多样
性也较丰富
(
图
2)
。
选用
Eco
R
Ⅰ和
Msp
Ⅱ组合获得的多态性条带，