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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1497
-
1504
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1497
-
1504
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1502
于进一步验证。至少有一点可以相信，油菜波里马
CMS
的恢复基因，与拟南芥中众多的
PPR
基因中的
At1g12300
是同源等位基因的可能性极高。
我们曾利用可扩增
BnPPR636
全长基因的引物
对甘蓝型油菜的一些品系进行
PPR
基因克隆，序列
分析的结果表明，
BnPPR636
基因在不同的品系之
间存在着广泛的核苷酸差异，这种多态性是否与表
型性状相关，尚需要进一步的试验验证。通过分析
BnPPR636
启动子的序列，发现该启动子序列中含
有许多转录因子的结合位点。半定量
RT-PCR
分析结
果，
BnPPR636
基因在花中表达量最高，其次是在
根中的表达量，表明
BnPPR636
与花和根的发育有
关。启动子结构分析发现其中含有与光调控相关的
应答位点、与根有关的组织特异性元件和与胁迫有
关的元件，进一步印证了
BnPPR636
与花和根的发
育相关。明确本研究克隆的
BnPPR636
基因的功能，
可以利用启动子序列，构建启动子驱动的
GUS
或者
GFP
表达载体进行遗传转化研究，观察其表达部位。
同时可以构建
BnPPR636
的正义或反义基因表达载
体，转化至油菜中，观察其生理生化变化，以进一
步确定
PPR
蛋白家族基因在甘蓝型油菜中的作用。
3
材料与方法
3.1
材料
实验材料为甘蓝型油菜
POL CMS
的恢复系
120
，
由中国农业科学院油料作物研究所油菜杂种优势
利用课题组提供。
3.2
试验载体，菌株及生化试剂
克隆载体
pMD18
-
T
、大肠杆菌菌株
DH5α
、
Ex
Taq
聚合酶
(5 U/μL)
购自宝生物工程
(
大连
)
有限公司。
DNA Marker
和
dNTPs (10 mmol/L)
购自鼎国
(
北京
)
公司；
Dnase
购于
Progema
公司，总
RNA
提取液
Triozol
和
RNA
反转录试剂盒购于
Invitrogen
公司，
DNA
回
收纯化试剂盒购于
OMEGA
公司。其他试剂均为国
产分析纯。
3.3
总
DNA
和总
RNA
的提取
采用
CTAB
法提取植物花蕾
DNA
，
Triozol
法提
取植物的总
RNA
，用
Dnase
消化以去除
DNA
污染，
1%
的琼脂糖凝胶电泳检测
DNA
和
RNA
质量。
3.4
BnPPR636
基因片段的克隆
根据在
NCBI
上已登录的植物
PPR
蛋白的氨基
酸序列，选取与拟南芥、白菜、萝卜和野芥等与甘
蓝型油菜亲缘关系较近的物种的
PPR
蛋白的氨基酸
序列为对比序列，提交到
Blockmaker (http:
∥
blocks1
-fhcrc1org/blocks/blockmkr/make-blocks1html)
进 行
保守区查找，将得到的保守区中最保守的氨基酸序
列提交到
CODEHOP
，综合考虑扩增片段的长度进
行引物设计。选用其中简并度小、
Tm
值适当及目的
片段长度合适的引物序列送上海生物工程公司合
成。
PCR
扩增体系为：
Taq
MIX 10 μL (
购自
GeneStar,
DNA
模板
1 μL,
正反向引物各
2.5 μL (10 μmol/L)
，
ddH
2
O 4 μL
。
PCR
扩增采用降落
(touchdown) PCR
程
序，即
95
℃
2 min
，
(94
℃
30 s, 55
℃
~40
℃
45 s, 72
℃
2 min)
，退火温度每个循环下降
1
℃，共
14
个循环；然
后
(95
℃
30 s, 40
℃
45 s, 72
℃
2 min)
，
25
个循环。
PCR
产物在
1.2%
琼脂糖凝胶上电泳检测，利用
OMEGA
公司的胶回收试剂盒回收产物，纯化后与
PMD18
-
T
载体连接，转化大肠杆菌
DH5α
，蓝白斑筛选重组
子，菌落
PCR
鉴定正确的阳性克隆送至英俊生物技
术服务有限公司
(
上海
)
测序。
3.5
BnPPR636
基因全长
cDNA
的克隆
按照
Clontech
公司的
SMARTer RACE cDNA
Amplification
试剂盒说明书的引物设计原则，利用
3.4
中获得的
PPR
基因片段核苷酸序列，分别设计
3'RACE
与
5'RACE
特异引物
GSP-F
：
5'
-
ATGGCGAACTAG-
AAGAGGCTTTGGG
-
3'
和
5'
-
GSP-R
：
CGCTCCTT-
TGACATTGAGGCTACAGA
-
3'
。
3'RACE
与
5'RACE
过程中
cDNA
第一条链的合成及
PCR
反应体系的配
置和扩增均按照
Clontech
公司试剂盒说明书进行。
PCR
反应的总体积为
50 μL
，成分为：
cDNA
第一链
2.5 μL
，
GSP (10 μmol/L) 1. 0 μL
，
UPM (10
×
) 5.0 μL
，
Master Mix 41.5 μL
。
PCR
反应程序为：
94
℃
30 s
，
72
℃
3 min
，
5
个循环；
94
℃
30 s
，
70
℃
30 s
，
72
℃
3 min
，
5
个循环；
94
℃
30 s
，
68
℃
30 s
，
72
℃
3 min
，
27
个
循环；共
35
个循环。
PCR
产物片段纯化、克隆和测
序同
3.4
。
3.6
BnPPR636
基因全长序列的
PCR
扩增
根据拼接
cDNA
序列的
5'
端和
3'
端设计引物
All-F (5
'-
GGAATGATTCATCTGAAGAAGAAGAA
-
3')
和
All-R (5'
-
TTATGATATGTCTCGAAAAGGAC-
CA
-
3')
，分别以基因组
DNA
及
cDNA
为模板扩增基因
全长，反应条件：
95
℃
3 min
；
94
℃
30 s
，
58
℃
30 s
，