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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1497
-
1504
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1497
-
1504
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1499
图
1 PPR
基因片段的扩增
注
: M: 2000 bp DNA ladder marker; 1: PPR
基因片段克隆
Figure 1 Amplification of PPR gene fragment from
B. napus
cDNA
Note: M: 2000 bp DNA ladder marker; 1: The fragment of PPR
gene
1.2
BnPPR636
基因全长序列的获得
3'RACE
扩增出单一的条带
(
图
2A)
，
5'RACE
扩
增出两条比较明显的条带
(
图
2B)
。测序发现
3'RACE
片段大小为
695 bp
，与拟南芥的
PPR
同源。
5'RACE
的两个片段序列中，小片段序列与拟南芥的
PPR
基
图
2 3'RACE(A)
和
5'RACE(B)
扩增产物的电泳图
注
: M: 2000 bp DNA ladder marker; 1: PCR
扩增产物
Figure 2 Amplified fragments of 3'RACE (A) and 5'RACE (B)
Note: M: 2000 bp DNA ladder marker; 1: Amplified fragments
因序列无同源性，属于非特异性扩增；大片段长度
为
1 629 bp
，与拟南芥的
PPR
同源。
5'RACE
与
3'RACE
的扩增片段存在
160 bp
的重叠序列，利用
CAP3
序列
拼接软件对
5'RACE
和
3'RACE
的序列进行全长序列
拼接，得到一条长度为
2 164 bp
的
cDNA
序列。经
ORF find
软件分析表明其开放阅读框序列为
+37
到
+1947
，总长为
1 908 bp
，编码
636
个氨基酸，因此
命名为
BnPPR636
。
BnPPR636
蛋白的理论分子量为
71.3 KD
，等电点为
8.11
。经保守区域数据库
(conserved
domain database, CDD)
分析表明
BnPPR636
具有
11
个
PPR
基序，属于典型的
PPR
蛋白家族成员
(
图
3)
。利用
拼接的
cDNA
序列设计引物，分别以
cDNA
和
DNA
为模板扩增
BnPPR636
cDNA
全长序列和基因组
DNA
序列时，获得了大小相等的片段
(
图
4)
。序列比
对分析发现，
BnPPR636
基因的
cDNA
序列与
DNA
序
列完全相同，不含内含子序列。
1.3
BnPPR636
的进化分析
在在
NCBI
上
Blast
搜索比对发现，
BnPPR636
与
白菜
P2
克隆的一个未知蛋白的氨基酸序列的一致
性最高，达到
75%
；与拟南芥的
PPR
序列和从萝卜
转育到甘蓝型油菜的
Ogura
细胞质雄性不育系统恢
复基因编码的氨基酸序列的一致性也较高。利用获
得的同源性较高的蛋白序列，包括白菜的
ABQ505-
46
、拟南芥的
CAR70003
、
Ogura
细胞质雄性不育系
统的恢复基因
ACJ70132
、萝卜的
ACM24117
、水稻的
ABC42330
、玉米的
ACN24620
、蓖麻的
XP0025201-
67
、高粱的
XP002465809
、杨树的
EEE76466
、卷柏的
XP002977337
和大麦的
CAJ32535
，采用
MEGA5.0
构
建不同物种的
PPR
蛋白的系统发育树。从构建的系
统发育树可以看出，
BnPPR636
与同为芸薹属的白
图
3 BnPPR636
序列中
PPR
基序分布
Figure 3 Distribution of PPR motif in BnPPR636